[发明专利]一种大批量纯化克级力学功能蛋白的方法

说明书

本申请属于生物工程技术领域，公开了一种方便、快捷、可大批量纯化力学功能蛋白的方法。该方法为表达ELP融合力学功能蛋白的发酵菌液预处理后经过镍亲和层析柱、除盐柱、SP离子交换层析柱纯化。本发明确定了一套针对力学功能蛋白的精细纯化方法，经过预处理、镍柱、除盐柱、离子交换柱分步处理后，并进行中试放大，最终得到纯度大于95％的力学功能蛋白，且每次获得量均达到克级水平。本发明可基于全自动蛋白纯化系统，操作简便。同时可实现蛋白样品的自动上样、自动洗涤、实时监控、在线检测等，能够根据样品状态及后续纯化要求来精细具体地调节纯化过程。

技术领域

本发明属于生物工程技术领域，具体涉及发明一种大批量纯化克级力学功能蛋白的方法。

背景技术

力学功能蛋白指一类具有一定力学强度的功能蛋白，包括丝心蛋白、蛛丝蛋白、节肢弹性蛋白、鱿鱼环齿蛋白等，主要为纤维状蛋白质，外形呈纤维状或细棒状，多数具有大量的β片层结构，此结构也是其具有较好的力学强度的关键。然而，过多的β片层会导致溶解性的降低，进而影响其在原核生物中的表达。

类弹性蛋白多肽(Elastin-like polypeptides,ELPs)是一种具有弹性功能且对环境温度非常敏感的人造基因工程蛋白质聚合物。其结构主要由五肽重复序列单元构成，即(Val-Pro-Gly-Xaa-Gly,VPGXG)，源自于弹性蛋白的疏水区域，其中Xaa可以是除Pro以外任意氨基酸。申请人将ELPs可重复序列中的四号氨基酸选取为赖氨酸，使其带有高电荷密度的正电荷，并将其与不同的力学功能蛋白进行融合表达，增加了力学功能蛋白溶解度的同时赋予了其一定的类弹性蛋白多肽的性质，从而研究其在生物医学材料如蛋白纤维，蛋白胶水，药物载体等方面的应用。

ELPs可随着温度的升高发生可逆的相变，即从可溶状态变成不溶的集合体，该温度即为相变温度(Tt)。ELP融合蛋白又称为ELPylation，即在目标蛋白的羧基端或氨基端连接ELPs，ELP融合蛋白继承了ELP的特性，即也能从可溶状态变成不溶的集合体。通过改变温度和离子强度等环境因素，从而引起ELP融合蛋白发生可逆性溶解，这一过程称为可逆相变循环(inverse transition-cycling，ITC)。通过ITC循环处理，ELP融合蛋白集合体能通过简单的离心或者超滤收集，并在低于相变温度或者改变其他环境条件时能重溶于缓冲液中。然而，对于带有大量正电荷的ELPs且融合了力学功能蛋白的融合蛋白，其可逆相变条件较难控制，目前还没有利用大体积纯化柱对此类蛋白进行亲和及离子交换层析的方法。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于针对现有技术中存在的问题，提供一种大批量纯化克级力学功能蛋白的方法。

为实现本发明的目的，本发明采用如下技术方案：

一种大批量纯化克级力学功能蛋白的方法，其特征在于，表达ELP融合力学功能蛋白的发酵菌液预处理后经过镍亲和层析柱、除盐柱、SP离子交换层析柱纯化。

在本发明中，所述发酵菌液为ELP融合力学功能蛋白构建pET25b原核表达载体，转化E.coli BLR(DE3)大肠杆菌，经过诱导表达筛选获得的稳定表达菌株发酵获得的菌液。所述与ELP融合的力学功能蛋白包括但不限于丝心蛋白、蛛丝蛋白、节肢弹性蛋白、鱿鱼环齿蛋白。

本发明所述ELP融合力学功能蛋白在构建时候引入了6×His标签，本发明采用用亲和及离子交换的方法对此类蛋白进行纯化，纯化步骤较少，蛋白纯度较高，并进行了等比例放大，且进行等比例放大无需额外设备，得到克级纯度为95％以上的大批量ELP融合力学功能蛋白，解决了力学功能蛋白其纯化产量低且溶解性不好的问题。

在本发明中，所述预处理为发酵菌液离心收集沉淀，洗涤后重悬，用高压破碎仪进行破碎，破碎后离心收集上清。

其中，所述发酵菌液离心和破碎后离心均为高速离心。进一步的，在一些实施方案中所述发酵菌液离心为8000rpm离心20min；所述破碎后离心为8000rpm离心20min。