[发明专利]磁性固定化酵母细胞及其在制备（R）-2-羟基-4-苯基丁酸乙酯中的应用

说明书

本发明公开了一种磁性固定化酵母细胞及其在制备(R)‑2‑羟基‑4‑苯基丁酸乙酯中的应用，所述磁性固定化酵母细胞是将赖氨酸修饰磁性纳米粒子与酵母细胞溶液混匀，20℃‑40℃、130‑170r/min摇床震荡中固定2‑6h，反应结束后，磁分离，沉淀用去离子水洗涤，冻干，获得磁性固定化酵母细胞。本发明固定化方法有效提高了酵母细胞的稳定性，增强了细胞对底物溶液的耐受性。在外加磁场的作用下磁性固定化细胞更易于从反应体系分离，有利于产物的分离提取，简化了工艺流程。在交变磁场反应器中合适的磁场频率和磁场强度能有效增强反应体系的传质过程，显著缩短还原反应时间，进而提高生物转化效率。

(一)技术领域

本发明涉及一种(R)-2-羟基-4-苯基丁酸乙酯的制备，特别涉及到使用氨基酸修饰的磁性纳米颗粒作为载体有效固定化酵母，并将其用于2-氧代-4-苯基丁酸乙酯的不对称还原制备(R)-2-羟基-4-苯基丁酸乙酯。

(二)背景技术

(R)-2-羟基-4-苯基丁酸乙酯(Ethyl(R)-2-hydroxy-4-phenylbutyrate，R-HPBE)，CAS号90315-82-5，分子式C₁₂H₁₆O₃，分子量208.25，密度为1.075g/mL，沸点为 212℃，不溶于水，易溶于有机溶剂。R-HPBE是合成赖诺普利、喹那普利、雷米普利、西拉普利等血管紧张素转化酶抑制剂(ACEI)类抗高血压和充血性心力衰竭药物的重要手性中间体，不对称还原2-氧代-4-苯基丁酸乙酯(OPBE)可以制备R-HPBE。

高血压病是一种由于血管神经调节障碍而升高动脉压力的慢性疾病，随着生活水平的提高，中、老年人已成为该病的多发人群，高血压影响血管脆性，过度时会引起血管破裂等问题，并引发心脑血管疾病，肾脏病、眼底疾病、神经系统疾病等，更为严重的是高血压还与高血糖、高血黏度、高血脂等疾病紧密联系在一起，造成全身各组织器官的慢性损害，导致身体脏器功能丧失，严重威胁人们的生命与健康。普利类药物由于其高效性和低副作用成为目前市场上主要的抗高血压药物，占高血压等疾病治疗药物市场的五分之一。R-HPBE在合成普利类药物(ACEI)中具有关键作用，ACEI 药物通过切断肾素-血管紧张素-醛固酮系统，阻断血管紧张素Ⅱ的生成从而达到扩张血管、降血压的作用。故R-HPBE的制备方法在国内外引起众多关注，近几十年来不断有人致力于新的R-HPBE的制备技术路线研发，以期获得一条经济、原子利用率高的绿色合成工艺。

采用化学法和生物法不对称还原OPBE均可以制备R-HPBE。化学法包括化学拆分法和化学合成法，化学拆分法是拆分其相应外消旋体2-羟基-4-苯基丁酸，再酯化为 R-HPBE，所用拆分剂为手性有机胺类化合物，化学拆分法存在的问题有：以光学纯苯乙胺类衍生物作拆分剂，由于其价格昂贵，实用价值不大；而氯霉素中间体拆分收率较低(小于50％)。而传统的化学合成法往往步骤繁多，催化剂价格较贵，环境污染严重，产物对映体过剩值不高，且催化反应需要很高的氢气压力，对设备要求高。而生物法因其光学选择性高、反应条件温和、环境友好等特性，成为目前合成R-HPBE 最有效的方法之一。生物合成法包括全细胞不对称还原法和羰基还原酶转化法。采用羰基还原酶不对称还原OPBE，需要提纯羰基还原酶并添加辅酶提高转化率，转化底物的量偏低。利用微生物全细胞催化还原反应是目前国际上制备R-HPBE有效且极有发展前景的方法之一，该方法反应条件温和、环境友好，成本低廉，催化效果理想，且反应体系可实现辅酶原位再生，具有良好的工业应用前景。但是，该方法需进一步解决的问题是提高反应的底物浓度，降低对细胞的抑制作用以及提高细胞对底物和有机溶剂的耐受性。为了提高细胞的耐受性和稳定性，本发明拟采用磁性固定化细胞转化OPBE制备R-HPBE，提高催化剂的重复利用次数，实现连续反应，提高生产效率。

与游离细胞相比，固定化细胞多次使用而没有明显的活性损失，具有较高的经济性。固定含有特定酶的细胞消除了分离和纯化酶的漫长而繁琐的程序，易于产物纯化，方便催化剂的回收利用。由于固定在载体上的生物催化剂无需重新填充，保留在载体上的微生物可实现连续生产。