[发明专利]一种外源表达PPARγ对肝脏脂肪变性及脂质代谢相关基因影响的研究方法

权利要求书

1.一种外源表达PPARγ对肝脏脂肪变性及脂质代谢相关基因影响的研究方法，其特征在于：

将实验小鼠分成三组，分别尾静脉注射LacZ腺病毒4d、PPARγ腺病毒2d、PPARγ腺病毒4d，处死后获取肝脏组织；肝脏组织经过制作石蜡切片进行HE染色、制作冰冻切片进行油红O染色、提取肝脏组织总RNA进行基因芯片分析；HE染色和油红O染色后观察肝脏脂肪病变程度；基因芯片分析用于筛选出外源性表达PPARγ引起肝脏中差异表达的基因。

2.根据权利要求1的研究方法，其特征在于，提取肝脏组织总RNA获取基因芯片的方法为：

用Takara RNA试剂盒提取三组肝脏组织的总RNA，运用生物素标记RNA探针，然后与小鼠Illumina WG-6Bead Chip杂交，得到三组小鼠的全基因转录数据。

3.根据权利要求1的研究方法，其特征在于，基因芯片分析的方法为：

通过NCBI数据库进行基因查找和比对，筛选出两组PPARγ腺病毒注射组与LacZ腺病毒注射组的差异表达基因，然后用GO基因富集分析、Venn Diagram和HeatMap研究差异表达基因的分布，从而获取差异基因的富集情况以及差异基因中的脂代谢相关基因的分布情况。

4.根据权利要求1的研究方法，其特征在于，还包括验证基因芯片结果的过程，其方法为：选择四个脂代谢差异表达基因为目的基因，以LacZ腺病毒注射组为对照组、PPARγ腺病毒4d注射组为实验组，使用实时定量PCR验证目的基因的表达情况，表达情况由mRNA相对丰度表示，目的基因的含量与内参基因含量比为目的基因的mRNA相对丰度；

其中，目的基因分别为PPARG、aP2、Lpin1和CideA；四个基因对应的引物分别为：

正向引物，5'-GGAAGACCACTCGCATTCCTT-3'；反向引物，5'-GTMTCAGCAACCATTGGGTCA-3'；

正向引物，5'-AAGGTGAAGAGCATCATAACCCT-3'；反向引物，5'-TCACGCCTTTCATAACACATTCC-3'；

正向引物，5'-CCTCCGCTCCCGAGAGAAA-3'；反向引物，5'-CGTTGTCTCCCAACTTCATGT-3'；

正向引物，5'-TGACATTCATGGGATTGCAGAC-3'；反向引物，5'-CATGGTTTGAAACTCGAAAAGGG-3'；

其中，内参基因为β-actin，其对应的引物为：

正向引物，5'-GTGACGTTGACATCCGTAAAGA-3'；反向引物，5’-CATGGTTTGAAACTCGAAAAGGG-3’。

5.根据权利要求1的研究方法，其特征在于，所述石蜡切片的制作方法为：

将肝脏组织经4％多聚甲醛固定后，按照以下步骤进行脱水：70％乙醇4h；80％乙醇2h；90％乙醇1h；95％乙醇2次，每次2h；100％乙醇2次，每次1h；二甲苯3次，每次1h；硬蜡2次，每次2h；脱水后石蜡包埋，切片即可。

6.根据权利要求1的研究方法，其特征在于，所述HE染色的方法为：

将石蜡切片按以下步骤脱蜡染色：二甲苯3次，每次7min；100％乙醇2次，每次1min；95％乙醇2次，每次1min；80％乙醇1min，70％乙醇1min，流水2min；苏木素染色7min，流水冲洗5min；盐酸乙醇分化15s，流水冲洗5min；伊红染色5min，然后脱水和透明，即80％乙醇15s；95％乙醇2次，每次1min；100％乙醇2次，每次1min；二甲苯3次，每次3min；中性树胶封片。

7.根据权利要求1的研究方法，其特征在于，所述冰冻切片的制作方法为：将肝脏组织进行OCT包埋，经冷冻切片机切片，置于-80℃冰箱储藏。

8.根据权利要求1的研究方法，其特征在于：所述油红O染色的方法为：

将冰冻切片复温干燥10min，50％乙醇稍洗，浸入60％异丙醇溶解的油红O染液10min，60％乙醇分化10s，流水冲洗2min,苏木素复染2s，1％盐酸乙醇分化15s，流水冲洗5min，甘油明胶封片。