[发明专利]一种外源表达PPARγ对肝脏脂肪变性及脂质代谢相关基因影响的研究方法

说明书

本发明公开了一种外源表达PPARγ对肝脏脂肪变性及脂质代谢相关基因影响的研究方法。该方法包括以下步骤：将实验小鼠分成三组，分别尾静脉注射LacZ腺病毒4d、PPARγ腺病毒2d、PPARγ腺病毒4d，处死后获取肝脏组织；肝脏组织经过制作石蜡切片进行HE染色、制作冰冻切片进行油红O染色、提取肝脏组织总RNA进行基因芯片分析；HE染色和油红O染色后观察肝脏脂肪病变程度；基因芯片分析用于筛选出外源性表达PPARγ引起肝脏中差异表达的基因。该方法为PPARγ在肝脏中的作用和肝病的治疗提供了一定的理论依据。

技术领域

本发明涉及脂质代谢领域，具体涉及一种外源表达PPARγ对肝脏脂肪变性及脂质代谢相关基因影响的研究方法。

背景技术

近年来，PPARγ在肝脏中的作用引起了人们的高度关注和广泛研究。在生物信息学方面，已有学者基于RNA-Seq研究了PPARγ在许多动物模型及相关疾病中的作用机制，但外源性表达PPARγ对小鼠肝脏脂肪变性及脂质代谢基因表达的影响一直未见报道。目前，噻唑烷二酮类药物(PPARγ激动剂)已被广泛应用于临床治疗2型糖尿病、代谢综合征、免疫性疾病等，但由于其所引起的水钠潴留、骨质丢失以及心力衰竭风险，限制了PPARγ受体激动剂临床普遍应用。随着生物技术的发展，基因治疗为临床疾病诊治带来了新的曙光。研究外源表达PPAR对肝脏脂肪变性及脂质代谢基因表达的影响，具有十分重要的意义。

发明内容

本发明的目的是提供一种外源表达PPARγ对肝脏脂肪变性及脂质代谢相关基因影响的研究方法。

该研究方法的主要步骤为：

将实验小鼠分成三组，分别尾静脉注射LacZ腺病毒4d、PPARγ腺病毒2d、PPARγ腺病毒4d，处死后获取肝脏组织；肝脏组织经过制作石蜡切片进行HE染色、制作冰冻切片进行油红O染色、提取肝脏组织总RNA进行基因芯片分析；HE染色和油红O染色后观察肝脏脂肪病变程度；基因芯片分析用于筛选出外源性表达PPARγ引起肝脏中差异表达的基因。

其中，提取肝脏组织总RNA获取基因芯片的方法为：用Takara RNA试剂盒提取三组肝脏组织的总RNA，运用生物素标记RNA探针，然后与小鼠Illumina WG-6Bead Chip杂交，得到三组小鼠的全基因转录数据。Takara RNA试剂盒的型号优选为D9108A。

其中，基因芯片分析的方法为：

通过NCBI数据库进行基因查找和比对，筛选出两组PPARγ腺病毒注射组与LacZ腺病毒注射组的差异表达基因，然后用GO基因富集分析、Venn Diagram(维恩图)和HeatMap(热图)研究差异表达基因的分布，从而获取差异基因的富集情况以及差异基因中的脂代谢相关基因的分布情况。

此外，该研究方法还包括验证基因芯片结果的过程，其方法为：

选择四个脂代谢差异表达基因为目的基因，以LacZ腺病毒注射组为对照组、PPARγ腺病毒4d注射组为实验组，使用实时定量PCR验证目的基因的表达情况，表达情况由mRNA相对丰度表示，目的基因的含量与内参基因含量比为目的基因的mRNA相对丰度；

其中，目的基因分别为PPARG、aP2、Lpin1和CideA；四个基因对应的引物分别为：

正向引物，5'-GGAAGACCACTCGCATTCCTT-3'；反向引物，5'-GTMTCAGCAACCATTGGGTCA-3'；

正向引物，5'-AAGGTGAAGAGCATCATAACCCT-3'；反向引物，5'-TCACGCCTTTCATAACACATTCC-3'；

正向引物，5'-CCTCCGCTCCCGAGAGAAA-3'；反向引物，5'-CGTTGTCTCCCAACTTCATGT-3'；