[发明专利]一种重组人纤连蛋白Ⅲ1-C及其制备方法和应用

说明书

本发明公开了一种重组人纤连蛋白Ⅲ1‑C蛋白及其制备方法和应用。根据密码子表达偏好性先优化了该目的蛋白的目的基因片段，再将所得的基因片段插入pET‑32a中建重组质粒；将该重组质粒转化导入表达载体BL21(DE3)中，经筛选得到了能高效可溶性表达的阳性克隆菌；再将阳性克隆菌经放大发酵培养后诱导表达，再经破碎、离心得到的上清液经His‑tag亲和层析柱洗脱、透析、过滤一次性步骤纯化后，即可得到蛋白浓度高达1.0mg/mL以上，纯度大于90％的rhFNⅢ1‑C优质蛋白溶液。通过促细胞粘附性试验检测观察，显示rhFNⅢ1‑C具有明显促进MDBK细胞和Balb/c/3T3细胞的贴壁、粘附和细胞快速分裂生长的性能，表明该蛋白具有作为药妆医美护肤原料和成品的巨大潜力。

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种重组人纤连蛋白Ⅲ1-C蛋白及其制备方法和应用。

背景技术

人皮肤由表皮层、真皮层、皮下组织及皮肤附属器官组成，具有保护、调节体温、新陈代谢和感觉等功能。其中表皮层和真皮层的状态与皮肤状态紧密相关，由细胞和胞外基质组成的细胞环境稳态与皮肤状态相关。纤连蛋白(fibronectin，FN)是一种高分子量(约440kDa)的细胞外基质的二聚体糖蛋白，它与整合素跨膜受体蛋白结合，由两个几乎相同的单体通过一对二硫键连接而成，其基因位于人类2号染色体上,由Ⅰ型、Ⅱ型、Ⅲ型3种同源性序列组成，在结构上该蛋白分为3个区域,即N端的明胶结合区，中间部分的细胞结合区和C端的Ⅱ型肝素结合区。Ⅰ型和Ⅱ型都含有两个二硫键，而Ⅲ型则没有二硫键，RGD序列在细胞的黏附及FN与其他蛋白的相互作用中具有重要作用,该序列位于细胞结合区的第10个Ⅲ型重复中，FN可通过RGD与受体相连，从而发挥调节作用。与整合素相似的是，纤连蛋白结合了细胞外基质成分，如胶原蛋白、纤维蛋白和肝素硫酸盐蛋白聚糖(如多配体聚糖)。FN广泛参与细胞迁移、黏附、增殖、止血及组织修复等过程，调动单核吞噬细胞系统清除损伤组织处有害物质，具有生长因子的作用。FN作为细胞培养的基质，可提高多种细胞的贴壁率、汇合率，缩短细胞汇合时间，使细胞形态结构良好，代谢率增强，DNA、RNA及蛋白质合成速度显著提高；细胞的集落率升高，原代培养成活率提高。FN作为一种胞外基质蛋白能够促进细胞增殖、粘附及其他胞外基质蛋白如胶原蛋白的形成，参与细胞迁移、黏附、增殖、止血及组织修复等过程，能促进单核吞噬细胞系统清除损伤组织处有害物质，具有生长因子的作用。现已知，纤连蛋白除已被用于创伤修复等临床应用外，还是一个重要的美容因子。

1999年，冯作化教授等在大肠埃希菌中表达了一种抗肿瘤转移多肽-人纤连蛋白Cell I-Hep Ⅱ-Cell Ⅱ三结构域重组多肽(CH82)，即重组人纤连蛋白Ⅲ1-C蛋白(recombinant human FNⅢ1-C，rhFNⅢ1-C)，其表达效率仅为21％。在37℃诱导下的该重组蛋白主要通过包涵体的形式分泌表达，需采用传统方法进行制备，即先用尿素进行变性，而后在缓冲液中透析复性而获得。此制备过程技术较繁杂且时间长，蛋白的活性易受损导致相应功能丧失。

目前现有技术中，尚未见有公开过rhFNⅢ1-C的研制技术及其应用方法。

发明内容

为解决上述技术问题，本发明提供了一种重组人纤连蛋白Ⅲ1-C(rhFNⅢ1-C)及其制备方法和应用，即根据密码子表达偏好性优化了人纤连蛋白Ⅲ1-C目的基因片段；将所得的基因片段插入pET-32a中构建出重组质粒，再将重组质粒转化导入表达载体BL21(DE3)中经筛选得到阳性克隆菌；该菌经放大发酵培养后即可诱导表达出目的蛋白rhFNⅢ1-C。经破碎、离心收集上清液，即可上样His-tag亲和层析柱纯化过滤后，可得到纯度大于90％rhFNⅢ1-C。因其具有促进细胞增殖、粘附及其他胞外基质蛋白如胶原蛋白的形成等功能，并能促进单核吞噬细胞系统清除损伤组织处有害物质，具有促生长因子的作用。因此，本发明研制的这种重组蛋白具有作为药妆护肤品原料和成品的巨大市场潜力。

本发明采取的技术方案为：

本发明公开了一种rhFNⅢ1-C，所述的rhFNⅢ1-C基因序列如SEQUENCE LISTING400〈3〉所示。