[发明专利]ddi1、rad23和dsk2三基因缺失的弓形虫虫株及其构建方法和应用

权利要求书

1.一种ddi1、rad23和dsk2三基因缺失的弓形虫虫株，其特征在于，所述弓形虫虫株中同时缺失泛素-蛋白酶体系统的三个穿梭蛋白基因：ddi1基因、rad23基因以及dsk2基因，其中，所述ddi1基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述rad23基因的核苷酸序列如SEQID NO.2所示，所述dsk2基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。

2.一种ddi1、rad23和dsk2三基因缺失的弓形虫虫株的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：

基础弓形虫虫株的准备：选用弓形虫基础虫株RHΔku80，该弓形虫基础虫株RHΔku80含有泛素-蛋白酶体系统的三个穿梭蛋白基因：ddi1基因、rad23基因和dsk2基因，所述ddi1基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述rad23基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，所述dsk2基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；

质粒构建：通过PCR扩增、无缝连接的方式获得构建所述弓形虫虫株所需要的质粒，分别是pTCR-ddi1-CD质粒、pTCR-rad23-CD质粒、pDHFR-dsk2质粒、pSAG1-CAS9-U6gRNA(ddi1)质粒、pSAG1-CAS9-U6gRNA(rad23)质粒和pSAG1-CAS9-U6gRNA(dsk2)质粒；

虫株的获得：将用于同源替换ddi1基因的pTCR-ddi1-CD质粒和用于定点打靶的pSAG1-CAS9-U6gRNA(ddi1)质粒共同电转至母源虫株RHΔku80中，经过药物筛选、PCR鉴定和单克隆筛选获得ddi1基因缺失的弓形虫虫株；将用于同源替换rad23基因的pTCR-rad23-CD质粒和用于定点打靶的pSAG1-CAS9-U6gRNA(rad23)的质粒共同电转至所述ddi1基因缺失的弓形虫虫株，经过药物筛选、PCR鉴定和单克隆筛选获得ddi1和rad23双基因缺失的弓形虫虫株；进一步将用于同源替换dsk2基因的pDHFR-dsk2质粒和用于定点打靶的pSAG1-CAS9-U6gRNA(dsk2)的质粒共同电转至所述ddi1和rad23双基因缺失的弓形虫虫株，经药物筛选、PCR鉴定和单克隆筛选，获得权利要求1所述的ddi1、rad23和dsk2三基因缺失的弓形虫虫株。

3.如权利要求2所述的ddi1、rad23和dsk2三基因缺失的弓形虫虫株的构建方法，其特征在于，所述pSAG1-CAS9-U6gRNA(ddi1)质粒是通过以下方法获得：以pSAG1-CAS9-U6gRNA(UPRT)质粒为模板，设计引物分别扩增得到片段1、片段2、片段3，然后将三个片段进行多片段无缝连接，将连接产物转化感受态细胞，培养基培养，PCR及测序鉴定，即得；其中，在扩增片段2的上游引物以及扩增片段3的下游引物中加入ddi1特异性的sgRNA，优选的，扩增所述片段1、片段2、片段3的引物如下：

1号片段引物(5’→3’)：

F：TCACTATAGGGCGAATTGGGTACC(SEQ ID NO.4)

R：CGCGCACTTTGTCTCGTCGC(SEQ ID NO.5)

2号片段引物(5’→3’)：

F：GGATCCACAGGTGGACGACGGTTTTAGAGCTAGAAATAG(SEQ ID NO.6)

R：CAATTCGCCCTATAGTGAGTCG(SEQ ID NO.7)

3号片段引物(5’→3’)：

F：GACGAGACAAAGTGCGCGAG(SEQ ID NO.8)

R：CGTCGTCCACCTGTGGATCCAACTTGACATCCCCATTTA(SEQ ID NO.9)。