[发明专利]HBV检测试剂盒及其使用方法和应用

说明书

本发明提供了一种HBV检测试剂盒及其使用方法和应用，涉及分子生物技术领域。本发明提供的HBV检测试剂盒包括核酸扩增试剂和样本处理液，检测时只需将待测样品和样本处理液直接加入核酸扩增试剂中，即可进行PCR扩增检测，极大地简化了试剂盒操作的全过程。并且最大程度上避免了核酸提取纯化过程中多步操作或技术问题导致的核酸丢失，且操作步骤简单方便，不需要大型精密的核酸提取纯化设备。此外，本发明提供的核酸扩增试剂中包括酶、dNTPs、金属阳离子、蛋白保护剂、HBV特异性引物、HBV特异性探针和缓冲体系，上述各组分配合使用，使得本发明提供的核酸扩增试剂能够在PCR反应中特异、高效地对待测样本进行扩增。

技术领域

本发明涉及分子生物技术领域，尤其是涉及一种HBV检测试剂盒及其使用方法和应用。

背景技术

随着分子生物学检测技术的发展，荧光定量PCR技术越来越多地被应用到临床病原体的检测中。目前，国内已有多种基于荧光定量PCR技术的乙型肝炎病毒(HBV)核酸定量检测试剂盒被应用于临床检测中。HBV核酸检测通常包括核酸提取纯化和核酸扩增检测两部分。

目前，市面上的HBV核酸提取纯化的方法主要可分为以下4种：(1)煮沸法：样本(或浓缩后的样本)加入裂解液并加热煮沸后高速离心，取部分上清进行扩增检测。该方法有效样本量小，检测灵敏度低，且高温煮沸及高速离心易产生污染而出现假阳性。(2)离心柱提取法：样本裂解后，核酸吸附到二氧化硅膜上，去除裂解液后进行2-3次洗涤，再洗脱下来作为模板进行扩增检测。柱提法提取的核酸纯度高，但步骤繁琐，且不易自动化，效率较低，多步操作易交叉污染。(3)磁珠法：样本裂解后，核酸吸附到磁珠表面，通过磁分离去除裂解液并进行1-3次洗涤，再洗脱下来作为模板进行扩增检测。磁珠法可实现自动化，但自动化硬件要求高，且仍需要多步操作，耗时仍较长，同时也存在交叉污染的风险。(4)室温裂解法：将待测样本与裂解液(核酸释放剂)混合均匀，室温处理5-10分钟，取部分或全部裂解混合物加入到PCR反应试剂中进行扩增检测。该方法虽然免去了富集纯化的繁琐步骤，节省了人力，但仍需要数分钟的裂解处理，同时处理多份样本时可能导致不同样本的处理时间不同，从而影响结果的稳定性。

另一方面，目前市面上的HBV核酸扩增检测试剂均为多组分的液体试剂，稳定性较差，对储存的要求较高，多数需要-20℃运输保存。同时，使用前需要将多种试剂配制在一起并混合均匀后分装到PCR反应管中，操作较繁琐，且不同人之间存在配制误差，同时存在污染的风险。为了解决上述问题，一种单管分装的，即开即用的，无需进行任何样本处理的，核酸裂解释放和PCR扩增检测同时进行的，且稳定性良好的HBV扩增检测试剂盒是人们所需要的。

申请号201811247122.5及201811247216.2公开了一种直接提取并扩增反应检测的试剂盒。该试剂盒将待测样本加入裂解液中实现核酸的裂解纯化，裂解后的产物直接加入即用型的冻干粉试剂中实现扩增检测。该方法解决了上述多组分液体试剂配液繁琐，稳定性差，且有污染风险等问题。但该试剂盒仍需要将样本与裂解液预先混匀并倒转3-5次后，取液相进行PCR扩增检测，样本量大时仍较耗时，且不易实现自动化。而且，该试剂盒的裂解液中含有聚乙二醇辛基苯基醚、苯酚等有机溶剂，对人体有害同时对环境产生污染。另一方面，该方法中的裂解液和样本的比例为5:1，裂解后仅取液相加入PCR反应试剂中进行反应，同时还要加入一定体积的水，可见，其有效的样本加入量远不足六分之一，极大地限制了检测灵敏度的提高。申请号CN201910541268.9公开了一种可以将未裂解的样本(或将未经裂解和/或未经核酸提取的样本重悬后)直接加入PCR反应体系中进行反应的PCR反应体系和试剂，该PCR反应体系含有一种或多种表面活性剂、一种或多种还原剂、一种或多种糖类物质、一种或多种醇类物质，同时还包含了抗抑制剂、核糖核酸酶抑制剂及常规PCR反应所需的组分，可检测的样本类型包括血清、血浆、全血、拭子、细胞或体液。该方法解决了样本需要预处理的问题，样本可直接加入到PCR反应试剂中，且血浆样本比例可达反应体积的25％。但该方法仅解决了样本无需处理的问题，未解决PCR反应试剂多组分配液复杂及储运要求高的问题。

有鉴于此，特提出本发明。