[发明专利]一种全人源化抗破伤风双特异性抗体及其构建方法和应用

说明书

本发明提供了一种全人源化抗破伤风双特异性抗体，该双特异性抗体包括单链单元A和单链单元B，单链单元A和B都包含了单链可变片段(scFv)、人IgG1的铰链区和Fc片段，其中该单链单元A的scFv对破伤风类毒素的以Trp1289为中心的区域具有特异性结合能力，单链单元B的scFv对破伤风类毒素的以Arg1216为中心的区域具有特异性结合能力。本发明还提供了该双特异性抗体的构建方法及其应用。经过小鼠的中和实验，表明该抗体具有中和保护作用，该双特异性抗体可用于作为诊断试剂检测破伤风类毒素抗原的质量，也可以替代破伤风抗毒素、马破伤风免疫球蛋白或人破伤风免疫球蛋白，用于被动免疫。

技术领域

本发明属于生物技术，涉及基因工程技术领域，更具体地，本发明公开了一类抗破伤风类毒素的双特异性抗体，尤其涉及一种全人源化抗破伤风双特异性抗体；此外，本发明还涉及该全人源化抗破伤风双特异性抗体的构建方法，以及该全人源化抗破伤风双特异性抗体在破伤风感染后的被动治疗中的应用。

背景技术

破伤风是由破伤风杆菌入侵创伤而引起的一种特异性感染，其主要致病原是破伤风杆菌产生的破伤风类毒素。破伤风类毒素是一个由1315个氨基酸组成的分子量约为150kDa的蛋白。该多肽在破伤风杆菌的蛋白水解酶作用后，在456和467氨基酸残基之间裂解成为分量大约为50KD轻链（LC）和100KD重链(LN)，LC和LN通过一对二硫键S439-S467连接。LC是锌依赖蛋白酶，在193-197位有一个锌指结合蛋白的功能域HELIH，375位的酪氨酸是一个催化活性位点。在864和863之间有一个木瓜蛋白酶(papin)切位点可以将重链进一步降解为N端（HCN）和C端（HCC或TTC）。HCN负责突触囊泡通过细胞质进入细胞质的膜，而TTC负责毒素结合神经元细胞。在TCC一段有两个区域，一是以Trp1289、His1271和Try1290为核心所形成的W pocket，其中Trp1289为中心。二是以Asp1147、Arg1226、Asn1216、Asp1214和Try1229为核心区域的R pocket，其中Arg1226为中心，这两个位点结合神经元的受体。当TTC结合神经元上神经节苷脂受体后，在HCN协助下，LC进入神经元后被运输到神经元胞质，在那里裂解可溶性NSF黏附蛋白(soluble NSF attachment protein (SNAP) receptor (SNARE)proteins)，通过水解突触囊泡蛋白Ⅱ而阻断神经抑制性介质的释放，阻断了神经元和运动神经元之间的信号传递，从而产生了破伤风特有的痉挛性瘫痪特征。表现为全身骨骼肌持续性强直和阵发性痉挛，重症患者可发生喉痉挛、窒息、肺部感染和器官功能衰竭，是一种极为严重的潜在致命性疾病。

目前对破伤风的认识是防重于治。破伤风在当下的预防措施包括注射破伤风类毒素主动免疫，正确处理伤口，以及在伤后采用被动免疫预防发病。最有效的方法是注射破伤风抗毒素(TAT)、马破伤风免疫球蛋白F(ab︐)₂或人破伤风免疫球蛋白(TIG) 。破伤风抗毒素(TAT)和马破伤风免疫球蛋白F(ab︐)₂均是用破伤风类毒素免疫马匹所制得的抗毒素，其纯度有所差异的，这两种形式的抗毒素来源于马匹，有一定程度过敏反应，而人破伤风免疫球蛋白(TIG)是破伤风类毒素免疫人体所制得的抗毒素，虽然无过敏性但具有较昂贵、来源少、制备复杂、供应不足等等缺点。我国临床上广泛使用的仍为TAT或马破伤风免疫球蛋白F(ab︐)₂，只有在过敏试验阳性或者家属主动要求的情况下才会使用TIG。因此，人们希望找到一种无过敏性且价格低廉的完全人特异性抗体，可以替代目前的抗体来源。

随着杂交瘤单克隆技术和噬菌体展示技术使用以来，人们逐渐在该领域中使用这些技术进行研究，但是这些研究仍存在的一些问题,比如:①有的文章未报道筛选到的单克隆抗体序列或者未进行测序；②筛选到的序列未进行克隆表达，仅做了序列分析；③克隆表达的序列仅仅进行了体外ELLISA和(或)体外结合实验，未知体内的保护作用；④有的序列表达后进行了小鼠体内中和保护实验，一种常见的思路就是多种单抗混合类似“鸡尾酒”方式，这种思路常有两种方案，一是分别表达单抗，再混合；一是混合表达单抗。前者是重组单抗的生产成本两倍以上，不具有生产应用价值。而后者具有产物纯度低和得率低导致成本很高的缺点。