[发明专利]一种基于双色荧光系统的活化CAR-T细胞的示踪及定量方法

权利要求书

1.一种基于双色荧光系统的活化CAR-T细胞的示踪及定量方法，其特征在于，包括如下步骤：

S1：合成第一插入序列，并在上下游引入AsisⅠ和MluⅠ酶切位点，然后酶切原始慢病毒载体A和得到的含有AsisⅠ和MluⅠ酶切位点的第一插入序列，将AsisⅠ和MluⅠ酶切后的第一插入序列与原始慢病毒载体A于22℃连接2小时，构建得到第一载体；

S2：合成第二插入序列，并在上下游引入AsisⅠ和MluⅠ酶切位点，然后酶切原始慢病毒载体B和得到的含有AsisⅠ和MluⅠ酶切位点的第二插入序列，将AsisⅠ和MluⅠ酶切后的第二插入序列与原始慢病毒载体B于22℃连接2小时，构建得到第二载体；

S3：取HEK293T细胞按1：3的比例传至细胞培养盘，并置于CO₂培养箱中培养24小时，获得待转染细胞，然后对待转染细胞更换含FBS的DMEM培养基，获得转染前细胞；

S4：取步骤S1制备的第一载体或步骤S2制备的第二载体、pMD2G质粒和psPAX2质粒加入DMEM培养基中制备得到试剂Ⅱ，取PlolyJet转染试剂加入DMEM培养基中制备得到试剂Ⅰ，将试剂Ⅰ与试剂Ⅱ混合后，逐滴加入至步骤S3制备得到的转染前细胞中，然后置于CO₂培养箱中培养24小时后，并更换含FBS的DMEM培养基，48小时后收取转染体系上清培养基，将上清培养基过孔径为0.22μm的滤膜后，超速离心滤液，弃上清，将沉淀重悬于TBS缓冲液中，获得第一载体或第二载体转染的慢病毒颗粒；

步骤S5：取外周血单个核细胞，计数细胞为1×10⁷个，以300g离心10min，以80uL的MACSBuffer每10⁷个细胞重悬，按照20uL每10⁷个细胞加入CD8⁺T磁珠，4℃孵育15min；然后按照1~2mL每10⁷个细胞加入MACS Buffer洗涤，以300g离心10min，弃去上清；以MACS Buffer重悬细胞至10⁸个/mL，将离心管置于稳定强磁场中，小心弃去上清，移去磁场，使用MACS Buffer稍用力洗涤并以300g离心10min，得到T细胞，将分选得到的T细胞重悬于RPMI1640 培养基中，并添加10% FBS，100U/mL IL-2和5ng/mL IL-15备用；

步骤S6：将步骤S4得到的第一载体和第二载体转染的慢病毒颗粒感染步骤S5分选得到的T细胞，感染过程中每隔一天用DMEM培养基对细胞进行换液，维持细胞浓度在(0.5~2)×10⁶个/mL，感染72小时后，分别选用嘌呤霉素和新霉素经过7天筛选，获得具有嘌呤霉素和新霉素双重抗性的多克隆细胞株，即双荧光CAR-T细胞；

步骤S7：将步骤S6得到的双荧光CAR-T细胞注射入动物体内，分别激发第一荧光和第二荧光，记录荧光位置并计算第一荧光积分光密度和第二荧光积分光密度，以此计算得到活化的CAR-T细胞比例；

所述步骤S1中，第一插入序列从5’端到3’端依次为血液肿瘤相关靶抗原、2A肽和第一荧光蛋白编码基因；

所述步骤S2中，第二插入序列从5’端到3’端依次为增强序列、启动子和第二荧光蛋白编码基因；

所述的增强序列与NFAT转录因子特异性结合，序列包括5’-DATGASTCAK-3’、5’-NDATGASTCATH-3’、5’-GAGAGTAGGGAA-3’、5’-AGCGCTCCAAAT-3’、5’-GCTTTAAGGCAA-3’、 5’-TGASTCABHNNNNNN-3’、5’-TGGAAATTTCCAVKB-3’和5’- GGAGGAAAAACTGTTTCATACAGAAGGCGT-3’中的任意一种及其反义链；所述的启动子包括EF1α、PGK1、Ubc、minP、minADH1和TATAbox中的任意一种；所述的第二荧光蛋白编码基因编码近红外荧光蛋白或远红外荧光蛋白，其中，所述的近红外荧光蛋白包括IFP1.4、IFP2.0、BDFP1.1、BDFP1.5、iRFP670、iRFP682、iRFP702、iRFP713、iRFP720、PAiRFP1、PAiRFP2、miRFP670、miRFP670-2、miRFP702、miRFP703、miRFP709、miRFP713、miRFP720和miRFP670nano中任意一种，所述的远红外荧光蛋白包括mKate2、E2-Crimson、mNeptune、iBlueberry、smURFP、TagRFP657和eqFP670中的任意一种。