[发明专利]一种基于双色荧光系统的活化CAR-T细胞的示踪及定量方法

说明书

本发明公开了一种基于多色荧光系统的活化CAR‑T细胞的示踪及定量方法，使用第一载体包装慢病毒并筛选稳转细胞，可以显示体内CAR‑T细胞总数量及所在位置。在此基础上转染第二载体包装的慢病毒，在CAR‑T细胞与靶细胞表面抗原结合并被成功激活之后，NFAT转录因子入核，与NFAT转录因子特异性增强序列结合并启动第二荧光表达，显示体内激活态的CAR‑T细胞的位置，同时通过计算即可得知活化的CAR‑T细胞占总输注细胞的比值，指示免疫活性细胞的激活状态、激活比例以及耗竭程度。本发明不仅可以实时追踪活化细胞所在位置，也可以计算出活化CAR‑T细胞所占比例，从而了解体内免疫过继细胞激活程度及存活时间，对后续治疗计划的维持及调整具有重要意义。

技术领域

本发明涉及细胞免疫治疗领域，具体涉及一种基于多色荧光系统的活化CAR-T细胞的示踪及定量方法。

背景技术

近年来，免疫疗法在肿瘤治疗中占据了越来越重要的地位。其中，嵌合抗原受体T细胞免疫疗法(Chimeric Antigen Receptor T-Cell Immunotherapy，CAR-T)在血液性肿瘤中得到了广泛应用并逐渐向实体瘤领域发展。CAR-T细胞是通过将与肿瘤抗原相对应的抗体的抗原结合部分与CD3-ζ链或FcεRIγ的胞内段形成的融合蛋白编码基因转染入患者的T细胞，使患者自身的T细胞能够表达肿瘤特异性的嵌合抗原受体，从而清除肿瘤细胞。

CAR-T细胞在体内发挥的疗效受到许多因素的影响，包括患者疾病状态、是否曾经接受化疗、输注CAR-T细胞的时机以及患者的基因表达状态等，其中两个重要因素就是修饰后的T细胞进入体内是否被有效激活，激活的T细胞是否持续活化。因此，在免疫细胞治疗的临床前研究中，一种能够快速、简便的监测免疫活性细胞的分布、迁徙、激活状态和存活时间的方法对于疗效的预测和评估具有重要意义。

当前，已经发展出的用于监测细胞分布、迁徙和存活时间的方法，包括组织病理学技术、核素成像技术、磁共振成像技术和光学成像技术等。然而，迄今为止，这些方法均不能够直接用于评估免疫活性细胞的激活状态、激活比例以及耗竭程度。因此，在免疫细胞治疗领域，亟需一种新的，能够实时监测患者体内CAR-T细胞状态的新方法。

发明内容

本发明的目在于针对现有CAR-T细胞治疗及临床研究过程中缺乏能够直接评估免疫活性细胞的激活状态、激活比例以及耗竭程度的检测方法的不足，提供一种基于多色荧光系统的活化CAR-T细胞的示踪及定量方法。使用第一载体包装慢病毒并筛选稳转细胞，该稳转细胞均能表达第一荧光蛋白，可以显示体内CAR-T细胞总数量及所在位置。在此基础上转染第二载体包装的慢病毒。在CAR-T细胞与靶细胞表面抗原结合并被成功激活之后，NFAT转录因子入核，与NFAT转录因子特异性增强序列结合并强烈启动第二荧光表达，显示体内激活态的CAR-T细胞的位置，同时通过计算第二荧光蛋白积分光密度与第一荧光蛋白的积分光密度的比值即可得知活化的CAR-T细胞占总输注细胞的比值，指示免疫活性细胞的激活状态、激活比例以及耗竭程度。

为实现上述目的，本发明提供的技术方案是：

一种基于多色荧光系统的活化CAR-T细胞的示踪及定量方法，其特征在于，包括如下步骤：

S1：合成第一插入序列，并在上下游引入AsisⅠ和MluⅠ酶切位点，然后酶切原始慢病毒载体A和得到的含有AsisⅠ和MluⅠ酶切位点的第一插入序列，将AsisⅠ和MluⅠ酶切后的第一插入序列与原始慢病毒载体A于22℃连接2小时，构建得到第一载体；

S2：合成第二插入序列，并在上下游引入AsisⅠ和MluⅠ酶切位点，然后酶切原始慢病毒载体B和得到的含有AsisⅠ和MluⅠ酶切位点的第二插入序列，将AsisⅠ和MluⅠ酶切后的第二插入序列与原始慢病毒载体B于22℃连接2小时，构建得到第二载体；