[发明专利]一种微生物快速定性定量的试剂盒以及快速定性定量的方法

说明书

本发明公开了一种微生物的快速定性定量的检测试剂盒以及快速定性定量的方法，属于微生物定性定量分析技术领域。本发明采用蛋白A和抗体B与待测微生物特异性结合形成复合物，蛋白A连接有磁珠，通过磁架分离复合物；向复合物中加入HRP标记的二抗，可以实现待测微生物的可视化检测；对于可视化检测阳性的样品进行RT‑PCR扩增进行定量分析。本发明试剂盒具有操作简便，无需对待测样本进行复杂的前处理；检测成本低，对检测仪器的要求低，结果可肉眼观察，特别适用于基层及偏远地区使用。当本发明用于微生物检测时，免去了样品前处理及靶标提纯，同时实现RT‑PCR扩增，有利于实现对微生物的定性和定量分析。

技术领域

本发明属于微生物定性定量分析技术领域，具体涉及一种微生物的快速定性定量的检测试剂盒以及快速定性定量的方法。

背景技术

目前用于微生物检测的方法，主要有传统的基于微生物培养的生化检验技术、分子生物学技术和免疫学检测方法等。

传统的微生物培养检验技术要经过培养、分离纯化、生化鉴定等步骤，存在操作繁琐耗时(3-7天)、检测灵敏度低、分析目标受限和容易出现假阳性结果等缺点，在应对突发性公共安全事件上，不能满足快速、准确、灵敏和特异性高等要求。

随着分子生物学的快速发展，对微生物的检测鉴定已不再局限于对其外部形态及生理特性等常规检验上，而是从分子生物学水平上研究生物大分子，由此衍生出了很多的分子检测技术，如DNA探针技术、聚合酶链式反应技术(PCR)、基因芯片技术等。尽管这些技术被广泛的用于微生物的检测，但无法达到直接检测微生物的目的，而且需要昂贵的高精密仪器支持与细胞裂解、DNA提取、扩增纯化等繁琐的样品处理过程，且无法区分微生物的生存形态。

免疫学检测方法的基本原理是抗原抗体的免疫反应，不同的微生物有其特异的抗原，并能激发机体产生相应的特异性抗体，因此免疫学检测技术能够直接用于检测致病微生物。然而，抗体的生产成本高，易失活并容易发生交叉污染，严重限制了免疫学检测方法在实际中的应用。无论是食品工业生产流程的检测和质控，还是政府部门对食品安全的监管，都迫切需要更加快速、灵敏、简单的食源性致病微生物检测方法。

发明内容

针对现有技术中存在的问题，本发明的目的在于提供一种微生物的快速定性定量的试剂盒以及快速定性定量的方法，以解决现有检测微生物技术中存在的灵敏度低、检测方法繁琐、仪器设备要求高等问题。

为了达到上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种微生物快速定性定量的试剂盒，包含定量反应体系和定性反应体系；

所述定性反应体系包含蛋白A磁珠、抗体B、磁架、HRP-二抗、洗脱液；

定量反应体系包含蛋白A磁珠、抗体B、磁架、洗脱液、RNA提取试剂、聚合酶、反转录酶、扩增缓冲液、dNTPs、扩增引物；

所述蛋白A为微生物靶向人体细胞的受体蛋白；

所述抗体B为特异性识别结合微生物表面外壳蛋白的IgG抗体；

所述蛋白A和抗体B可与待检测微生物特异性结合形成三元复合体。

在上述方案的基础上，所述的蛋白A磁珠由以下方法制备而成：

称取200mg蛋白A，169.31mg EDC和47.98mg NHSS，分别溶于无菌的PBS溶液中，然后混合通过碳化二亚胺法，活化蛋白A，活化10min；将活化后的蛋白A加入到牛血清白蛋白修饰的磁珠中，孵育6h；反应完毕后，用无菌的PBS洗涤3次，重悬于10mL无菌的PBS溶液中，即得浓度为20mg/mL的蛋白A包裹磁珠。

在上述方案的基础上，所述的磁珠为四氧化三铁磁珠。

在上述方案的基础上，所述微生物为食源性致病菌、冠状病毒、流感病毒、乙肝病毒中的任意一种。