[发明专利]一种蚯蚓抗菌肽的表达方法

权利要求书

1.一种蚯蚓抗菌肽的表达方法，其特征在于，利用麦芽糖启动子在枯草芽孢杆菌中表达蚯蚓抗菌肽。

2.根据权利要求1所述的蚯蚓抗菌肽的表达方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：

S1、连接枯草芽孢杆菌改进型麦芽糖操纵元启动子序列、优化的淀粉酶信号肽序列SPamyQ(+)、优化的SUMO序列和蚯蚓抗菌肽基因序列，得到蚯蚓抗菌肽表达序列；

S2、利用限制性内切酶和DNA连接酶将所述蚯蚓抗菌肽表达序列插入枯草芽孢杆菌表达载体得到抗菌肽的枯草芽孢杆菌表达载体；

S3、将枯草芽孢杆菌进行基因替换，把基因组中的P_glv启动子替换为P₄₃启动子，得到基因替换的枯草芽孢杆菌；

S4、将步骤S2中所述抗菌肽的枯草芽孢杆菌表达载体在步骤S3得到的基因替换的枯草芽孢杆菌中高效表达；

S5、将步骤S4中分泌的SUMO-抗菌肽进行亲和层析纯化；

S6、利用SUMO蛋白酶对步骤S5中所得的纯化SUMO-抗菌肽进行切割得到蚯蚓抗菌肽；

S7、利用亲和层析纯化步骤S6中所得蚯蚓抗菌肽。

3.根据权利要求2所述的蚯蚓抗菌肽的表达方法，其特征在于，所述改进型麦芽糖操纵元启动子为Pglv-M1，其序列如SEQ ID NO:3所示。

4.根据权利要求2所述的蚯蚓抗菌肽的表达方法，其特征在于，所述蚯蚓抗菌肽基因为蚯蚓抗菌肽LumbricinⅠ(6-34)基因。

5.根据权利要求2所述的蚯蚓抗菌肽的表达方法，其特征在于，所述优化的淀粉酶信号肽序列SP amyQ(+)如SEQ ID NO:4所示；优化的SUMO序列如SEQ ID NO:5所示。

6.根据权利要求2所述的蚯蚓抗菌肽的表达方法，其特征在于，所述蚯蚓抗菌肽表达序列如SEQ ID NO:1所示。

7.根据权利要求2所述的蚯蚓抗菌肽的表达方法，其特征在于，步骤S2中，所述枯草芽孢杆菌表达载体为枯草芽孢杆菌分泌载体pHT43。

8.根据权利要求2所述的蚯蚓抗菌肽的表达方法，其特征在于，步骤S3具体为：利用PCR分别扩增出枯草芽孢杆菌基因组中的P43启动子序列、Pglv启动子的前端序列GAF和后端序列GAB、质粒中的卡那霉素抗性基因KAN，利用overlap PCR技术连接四段基因，得到GAF-KAN-P43-GAB基因片段；将所述基因片段转入枯草芽孢杆菌中，利用含有卡那霉素的培养基筛选出含有卡那霉素抗性的枯草芽孢杆菌，即得所述基因替换的枯草芽孢杆菌。

9.根据权利要求8所述的蚯蚓抗菌肽的表达方法，其特征在于，所述枯草芽孢杆菌为枯草芽孢杆菌WB800N。

10.根据权利要求8所述的蚯蚓抗菌肽的表达方法，其特征在于，所述GAF-KAN-P43-GAB基因片段的序列如SEQ ID NO:2所示。