[发明专利]一种蚯蚓抗菌肽的表达方法

说明书

本发明公开了一种蚯蚓抗菌肽的表达方法；通过构建改进型麦芽糖操纵元启动子P_glv‑M1，淀粉酶信号肽序列SP amyQ、SUMO序列和抗菌肽序列所构成的枯草芽孢杆菌表达载体，实现利用麦芽糖作为诱导物表达蚯蚓抗菌肽；利用SUMO蛋白酶切割所得目标蛋白后，利用亲和层析纯化得到蚯蚓抗菌肽LumbricinⅠ(6‑34)。纯化产物对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、酿酒酵母等都有抑菌作用。本发明采用枯草芽孢杆菌作为表达宿主，不含内毒素，便于纯化；采用启动子P_glv‑M1，麦芽糖作为诱导物，并减弱了葡萄糖对其的抑制作用；对各段序列进行了优化，提高表达产量；融合蛋白可分泌至细胞外，减少纯化步骤。

技术领域

本发明属于生物技术和基因工程技术领域，具体的，本发明涉及一种利用改进的麦芽糖操纵元枯草芽孢杆菌表达系统表达蚯蚓抗菌肽的方法。

背景技术

随着抗菌药物的滥用，环境中和动植物体内的抗菌药物残留会导致耐药细菌的出现。这两者都会直接或间接地影响人体的生命健康安全，因此新型抗菌药物的研发迫在眉睫。蚯蚓作为一种重要的土壤动物，其生活在含有大量微生物的土壤环境中，但是在收到部分损伤后，蚯蚓能够自愈，并且很少出现感染的情况。科学研究表明蚯蚓体内含有多种抗菌肽，蚯蚓抗菌肽具有成为新型抗菌药物的潜力。

目前蚯蚓抗菌肽主要是通过物理化学或者微生物刺激蚯蚓，然后从蚯蚓体内分离。但是这样的分离成本较高，并且分离得到的大多为多种蛋白质的混合物，得不到纯度较高的抗菌肽。对于其他种类的抗菌肽，目前则主要采用基因工程和发酵工程的方法进行异源表达。这些抗菌肽主要利用大肠杆菌或酵母表达系统进行表达，例如赵晓瑜等利用大肠杆菌表达了蚯蚓抗菌肽Fetidin。但是大肠杆菌细胞壁具有内毒素，表达的抗菌肽容易形成包涵体；酵母菌发酵后期对培养基的要求较高。与之相比，枯草芽孢杆菌是一种公认的安全的微生物，没有内毒素，自身是一种对牲畜生长有利的益生菌，并且对培养基的要求不高，表达蛋白质也不容易出现包涵体。因此采用枯草芽孢杆菌表达系统更具有优势。但是枯草芽孢杆菌的诱导型启动子中表达效率较高的启动子的诱导物价格较高、有毒或者容易受到抑制，例如李富伟等利用pHT43质粒中携带的启动子Pgrac表达了ew T1，但是启动子P_grac的诱导物IPTG价格昂贵且有毒性，并且由于未在抗菌肽基因序列之前加入蛋白标签的序列，直接表达的抗菌肽会对表达宿主枯草芽孢杆菌也产生危害，因此表达产量不高，且纯化较为困难；此外较强的枯草芽孢杆菌的诱导型启动子还有P_xyl等，启动子P_xyl的诱导物为木糖，较为安全但是价格较为昂贵并且受到葡萄糖的抑制。因此限制了对枯草芽孢杆菌表达系统的利用。

发明内容

本发明的目的是提供一种蚯蚓抗菌肽的表达方法；具体是利用改进型麦芽糖操纵元枯草芽孢杆菌表达系统表达蚯蚓抗菌肽的方法。

本发明的目的是通过以下技术方案来实现的：

本发明涉及一种蚯蚓抗菌肽的表达方法，利用麦芽糖启动子在枯草芽孢杆菌中表达蚯蚓抗菌肽。

进一步的，所述方法包括以下步骤：

S1、连接枯草芽孢杆菌改进型麦芽糖操纵元启动子序列、优化的淀粉酶信号肽序列SP amyQ(+)、优化的SUMO序列和蚯蚓抗菌肽基因序列，得到蚯蚓抗菌肽表达序列；

S2、利用限制性内切酶和DNA连接酶将所述蚯蚓抗菌肽表达序列插入枯草芽孢杆菌表达载体得到抗菌肽的枯草芽孢杆菌表达载体；

S3、将枯草芽孢杆菌进行基因替换，把基因组中的P_glv启动子替换为P₄₃启动子，得到基因替换的枯草芽孢杆菌；

S4、将步骤S2中所述抗菌肽的枯草芽孢杆菌表达载体在步骤S3得到的基因替换的枯草芽孢杆菌中高效表达；

S5、将步骤S4中分泌的SUMO-抗菌肽进行亲和层析纯化；