[发明专利]一种枯草芽孢杆菌线性质粒系统的构建与应用

权利要求书

1.一种基因表达系统，其特征在于，所述表达系统含有线性质粒及（a）或（b），所述线性质粒从5’端向3’端依次含有左复制原点、启动子、目的基因和右复制原点，所述左复制原点如SEQ ID NO.3所示，所述右复制原点如SEQ ID NO.4所示；其中，

（a）为携带SEQ ID NO.1所示基因簇的质粒；

（b）为在基因组上整合了SEQ ID NO.1所示基因簇的细胞；

所述细胞是枯草芽孢杆菌细胞。

2.根据权利要求1所述的基因表达系统，其特征在于，所述启动子为启动子P_lytr或P₄₃。

3.根据权利要求1所述的基因表达系统，其特征在于，所述携带SEQ ID NO.1所示基因簇的质粒核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；所述线性质粒的序列如SEQ ID NO.5所示。

4.根据权利要求3所述的基因表达系统，其特征在于，所述线性质粒中编码绿色荧光蛋白基因替换为其它目的基因，所述其它目的基因为编码目的蛋白的基因。

5.含有线性质粒的细胞；

所述线性质粒依次含有左复制原点、启动子、目的基因和右复制原点，所述左复制原点如SEQ ID NO.3所示，所述右复制原点如SEQ ID NO.4所示；

所述细胞还含有携带SEQ ID NO.1所示基因簇的质粒，或所述细胞基因组上整合了SEQID NO.1所示基因簇；

所述细胞是枯草芽孢杆菌细胞。

6.根据权利要求5所述的细胞，其特征在于，所述细胞是枯草芽孢杆菌168或枯草芽孢杆菌168 △spo0A::lox72；

所述枯草芽孢杆菌168 △spo0A::lox72，是在枯草芽孢杆菌168中敲除了spo0A基因，所述spo0A基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示。

7.一种构建权利要求1~4任一所述基因表达系统的方法，其特征在于，包括如下步骤：（1）构建含有左复制原点、启动子、目的基因和右复制原点的线性质粒；（2）将步骤（1）构建的线性质粒转入整合有SEQ ID NO.1所示基因的宿主细胞中，或将步骤（1）构建的线性质粒与含有携带SEQ ID NO.1所示基因的质粒转入宿主细胞中。

8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述步骤（1）中左复制原点、启动子、目的基因和右复制原点通过吉布森组装融合。

9.权利要求1~4任一所述的基因表达系统在表达天然蛋白、人工蛋白或多肽中的应用。