[发明专利]一种枯草芽孢杆菌线性质粒系统的构建与应用

说明书

本发明公开了一种枯草芽孢杆菌线性质粒系统的构建与应用，属于枯草芽孢杆菌基因工程领域。本发明以枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)作为表达宿主，通过在枯草芽孢杆菌内表达来源于枯草芽孢杆菌噬菌体phi29的基因组复制相关基因簇，从而实现线性质粒在胞内的复制与表达。通过更换不同的启动子，可以控制线性质粒的拷贝数与表达水平。经验证，应用该线性质粒系统表达绿色荧光蛋白，在摇瓶培养70h后未发生质粒丢失的情况，这种新型的表达工具为实现枯草芽孢杆菌高效稳定的基因表达，基因编辑，代谢工程改造等奠定了基础。

技术领域

本发明涉及一种枯草芽孢杆菌线性质粒系统的构建与应用，属于枯草芽孢杆菌基因工程领域。

背景技术

枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)在自然界广泛分布，包括土壤表面，水环境和动物胃。作为革兰氏阳性菌的模型微生物，用于孢子形成机制和代谢调节的实验室研究。它是一种非致病微生物，不含内毒素，通常被美国食品和药物管理局(FDA)认可为安全的(GRAS)食品级微生物。此外，枯草芽孢杆菌具有许多优点，包括：生长速度快，培养时间短，培养要求低；分泌信号肽的系统十分高效，使得其分泌蛋白能力强，这对后续蛋白提取工艺提供了很大便利；其分子伴侣系统十分高效，使得其在表达大部分真核来源的蛋白时，可以使得蛋白仍然保持其原有构象和活性。枯草芽孢杆菌的优势使得其在发酵行业应用十分广泛，其被广泛用于工业酶生产，高附加值产品的生物合成。其表达系统在分泌和表达活性蛋白上的优点逐渐引起人们的关注,并有可能成为继大肠杆菌之后的重要的原核表达系统。然而，用于提高蛋白表达量的工具质粒却十分不稳定，容易发生丢失的情况，需要抗生素维持(Zhang XZ,Cui ZL,Hong Q,Li SP.High-level expression and secretion of methylparathion hydrolase in Bacillus subtilis WB800.Applied and environmentalmicrobiology.2005；71(7):4101-3)，因此带有工具质粒的枯草芽孢杆菌菌株难以用于工业生产且不适用于食品及制药的生产。

对于实现枯草芽孢杆菌新一代工具载体的开发，目前尚未有报道，对于基因的表达目前主要使用的是环形质粒和在基因组上表达两种，开发新型有效的的线性质粒系统可能为后续酶工程、代谢工程等领域打下基础。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种适用于枯草芽孢杆菌的线性质粒工具及其应用，通过在枯草芽孢杆菌内表达来源于枯草芽孢杆菌噬菌体phi29的基因组复制相关基因簇，以实现线性质粒在胞内的复制与表达。

本发明的第一个目的是提供一种线性质粒，依次含有左复制原点、启动子、目的基因和右复制原点，所述左复制原点如SEQ ID NO.3所示，所述右复制原点如SEQ ID NO.4所示。

在一种实施方式中，所述启动子为启动子P₄₃。

在一种实施方式中，所述线性质粒的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示。

本发明的第二个目的是提供一种表达系统，所述表达系统为(a)或(b)，目的基因通过线性质粒表达；其中，

(a)含有所述线性质粒及携带SEQ ID NO.1所示基因簇的质粒；

(b)含有所述线性质粒及在基因组上整合了SEQ ID NO.1所示基因簇的细胞。

在一种实施方式中，(a)为双质粒表达系统，(b)为单质粒表达系统。

在一种实施方式中，所述双质粒表达系统的两个质粒均位于同一细胞中。

在一种实施方式中，携带SEQ ID NO.1所示基因簇的质粒为p43NMK。

在一种实施方式中，双质粒表达系统中，携带SEQ ID NO.1所示基因簇的质粒具有如SEQ ID NO.2所示核苷酸序列。