[发明专利]一种增强抗体-荧光微球偶联物信号的方法以及在肌钙蛋白I检测中的应用

说明书

本发明公开了一种增强抗体‑荧光微球偶联物信号的方法，将抗体与荧光微球偶联得到抗体‑荧光微球偶联物，将抗体‑荧光微球偶联物再与荧光素偶联，得到增强型抗体‑荧光微球偶联物。抗体‑荧光微球偶联物与荧光素偶联前，使用惰性蛋白将荧光微球表面空位进行封闭。该方法充分利用偶联完成后荧光微球表面的蛋白质羧基/氨基，再次进行荧光素的共价偶联，使荧光信号进一步增强，提高检测灵敏度。本发明还公开该方法在肌钙蛋白I检测中的应用。

技术领域

本发明涉及荧光层析技术领域，具体涉及一种增强抗体-荧光微球偶联物信号的方法以及在肌钙蛋白I检测中的应用。

背景技术

免疫层析技术作为Poct(Point of Care Testing，即时检测)的重要分支始于20世纪80年代，其中早早孕试纸以其方便、快捷、价格低廉的特点成为最成功的产品，同时层析技术也拓展到了很多检测领域，但是与ELISA(酶联免疫分析)、化学发光这些方法学比较起来也有相应的短板，主要表现在精密度差，灵敏度不足；因此在二十世纪初各厂家为改善层析产品性能将胶体金更换为荧光物质，产品性能得到较大提升，荧光层析产品逐渐取代胶体金成为市场主流。早期荧光层析使用荧光素，现在逐渐转变为荧光微球，因为荧光微球含有更多的荧光物质，可有效放大荧光信号，提高检测灵敏度。在当前的荧光层析研究中，要进一步提高产品性能的关键是再次去提高偶联物的荧光信号。

当前的抗体-荧光微球偶联一般采用化学偶联，先将微球表面基团(一般是羧基)活化，加入抗体，抗体的氨基与活化后的羧基结合，固定至微球表面，再使用惰性蛋白(一般是BSA)进行将微球表面空位进行封闭。

灵敏度由捕获在检测线上的荧光物质强度所决定，而现有的抗体-荧光微球偶联技术，通常都是很多个抗体对应一个荧光微球，因此检测线在捕获抗体-荧光微球偶联物时，捕获很多抗体才能有一个荧光微球的荧光强度。

心肌肌钙蛋白是心肌收缩的调节蛋白，存在于心肌收缩蛋白的细肌丝上。心肌损伤早期，心肌细胞未坏死，但细胞膜破坏，游离形式的cTnI进入组织间隙，经淋巴回流入血。血清cTnI于6h升高，其后肌原纤维不断崩解破坏，固定形式的cTnI不断释放，血清水平于18-24h达高峰，10天后降至正常。肌钙蛋白I(cTnI)具有高度的心肌特异性和灵敏度，是目前公认的较理想的心肌梗死(AMI)标志物。如今为了更加准确的预测心血管风险，cTnI进入了超敏时代，对荧光层析的灵敏度提出了更高了要求。

发明内容

为了解决上述技术问题，本发明公开一种增强抗体-荧光微球偶联物信号的方法，该方法充分利用偶联完成后荧光微球表面的蛋白质羧基/氨基，再次进行荧光素的共价偶联，使荧光信号进一步增强，提高检测灵敏度。本发明还公开该方法在肌钙蛋白I检测中的应用。

本发明通过下述技术方案实现：

一种增强抗体-荧光微球偶联物信号的方法，将抗体与荧光微球偶联得到抗体-荧光微球偶联物，将抗体-荧光微球偶联物再与荧光素偶联，得到增强型抗体-荧光微球偶联物。抗体-荧光微球偶联物与荧光素偶联前，使用惰性蛋白将荧光微球表面空位进行封闭。

荧光层析技术的关键指标是灵敏度，而灵敏度是由荧光物质的多寡决定的。当前的抗体-荧光微球偶联一般采用化学偶联，先将微球表面基团(一般是羧基)活化，加入抗体，抗体的氨基与活化后的羧基结合，固定至微球表面，再使用惰性蛋白(一般是BSA)进行将微球表面空位进行封闭。发明人发现，在偶联完成后，偶联物的荧光只来自荧光微球本身，微球表面遍布蛋白质(由抗体和BSA组成)，而这些蛋白质含有的大量氨基/羧基未得到充分利用。

本发明将抗体与荧光微球偶联完成后，利用荧光微球表面的抗体和封闭用蛋白上的大量可用氨基(-NH2)，与荧光素再进行偶联，使得单个微球携带的荧光增多，大大增强了整个偶联物的荧光信号强度，提高检测灵敏度。

一种增强抗体-荧光微球偶联物信号的方法在肌钙蛋白I检测中的应用，包括以下步骤：