[发明专利]利用甲醇和木糖共底物产脂肪酶的基因工程菌及其应用

说明书

本发明涉及利用甲醇和木糖共底物产脂肪酶的基因工程菌及其应用，向宿主菌中导入甲醇氧化酶基因aox1、二羟基丙酮合酶基因das、过氧化氢酶基因cta和二羟基丙酮激酶基因dak；所述宿主菌为可利用木糖产脂肪酶的南极假丝酵母。本发明利用合成生物学的方法将甲醇代谢途径引入南极假丝酵母中，从而实现南极假丝酵母以非食品级原料甲醇和木糖作为共底物生产脂肪酶，在一定的程度上降低了生产成本，具有重大的意义和经济价值。

技术领域

本发明属于生物工程领域，特别涉及一株利用甲醇和木糖共底物产脂肪酶的基因工程菌及其应用。

背景技术

微生物脂肪酶种类繁多，广泛存在于生物体内，因具有比动物脂肪酶更广的作用pH、作用温度范围等优点，以及在酶理论研究和实际应用中的作用而得到广泛研究，脂肪酶可催化酯类化合物的分解、合成、酯交换等多种反应，具有高度的化学、区域和立体选择性，近几年，在有机合成、制药、去污剂、生物表面活性剂等领域得到广泛应用。

南极假丝酵母脂肪酶是一种重要的脂肪酶，具有许多优良的特性，由于它是一种新型的非特异性酶，它无论在溶液中还是以固定化形式存在时均具有很强的稳定性，在进行热处理时酶活最初下降很快，但在一段时间后酶活力便稳定下来，即使进行进一步的热处理也不会有明显变化，其在水解反应和有机合成反应中具有很高的立体选择性，在糖脂的合成中也具有潜在的应用价值。目前，生产南极假丝酵母脂肪酶的培养基成本较高，使南极假丝酵母脂肪酶生产成本较高，因此，若能以廉价的还原性的底物为原料，可以在一定程度上降低成本。

甲醇是煤化工产业中的重要产品，近年来随着甲醇工艺的发展，使得甲醇的价格持续走低，因而利用甲醇作为发酵原料成为生物转化过程降低成本的重要突破口。因此，若能通过合成生物学的手段，将甲醇代谢模块引入南极假丝酵母中，以甲醇和木糖为共底物生产脂肪酶，为利用廉价碳资源生产脂肪酶的研究奠定了基础。

发明内容

本发明的目的在于提供一种利用合成生物学的方法构建可以利用甲醇和木糖共底物进行代谢的菌株，并利用该菌株发酵产脂肪酶，解决了传统产脂肪酶成本高的问题。

为解决上述问题，本发明采用如下方案：

一株利用甲醇和木糖共底物产脂肪酶的基因工程菌，通过向宿主菌中导入甲醇氧化酶基因aox1、二羟基丙酮合酶基因das、过氧化氢酶基因cta和二羟基丙酮激酶基因dak；所述宿主菌为可利用木糖产脂肪酶的南极假丝酵母。

其中甲醇氧化酶基因将甲醇氧化成甲醛，消耗大量氧气伴随生产过氧化氢；过氧化氢在过氧化氢酶cta的催化下转化成氧气和水；甲醛和木酮糖-5磷酸在二羟基丙酮合酶das的催化下转化成二羟基丙酮，同时外源添加木糖为其提供木酮糖-5磷酸加速二羟丙酮的产生；随后二羟基丙酮在二羟基丙酮激酶dak的催化下转化成磷酸二羟丙酮，然后进一步代谢成果糖-6磷酸，进而进入糖酵解途径参与物质循环和有机酸代谢，如图1。南极假丝酵母可以利用木糖作为碳源，木糖代谢的木酮糖-5磷酸可作为甲醇代谢的前体，因此木糖可以加速甲醇的代谢从而提高构建菌株脂肪酶的相关酶活。

其中所述宿主菌为南极假丝酵母(Candida antarctica)ZJB09193，保藏编号为CCTCC M2010263，该菌株已在文献Liu et.al.Cloning,expression andcharacterization of a lipase gene from the Candida antarctica ZJB09193 andits application in biosynthesis of vitamin A esters.MicrobiologicalResearch.Volume 167,Issue 8,6September 2012,Pages 452-460中公开。本申请人在此声明，保证从本申请日起20年内免费对公众发放本菌株的生物材料。