[发明专利]通过等温扩增技术检测样品中核酸的方法及其试剂盒

说明书

本发明提供一种通过等温扩增技术检测样品中核酸的方法及其试剂盒。所述方法包括同时提取所述样品中DNA和RNA、在核酸扩增液中等温扩增提取的DNA和RNA和对核酸扩增产物进行检测。本发明的方法检测样本总核酸，增加靶标的量，提高检测的灵敏度；反应速度快，时间短，提高了检测效率，和特异性高。

技术领域

本发明涉及分子生物学技术领域，特别涉及通过等温扩增技术检测样品中核酸的方法。

背景技术

分子诊断技术是指以DNA和RNA为诊断材料，用分子生物学技术通过检测基因的有无和多少，从而对人体状态和疾病作出诊断。其基本原理是检测DNA或RNA的结构是否变化、量的多少及表达功能是否异常，以确定受检者有无基因水平的异常变化，对疾病的预防、预测、诊断、治疗和预后具有重要意义。目前的分子生物学检测技术主要包括聚合酶链式反应(PCR)检测技术、Sanger测序技术和高通量测序技术、等温扩增技术等。

PCR技术即聚合酶链式反应是一种用于放大扩增特定的DNA片段的分子生物学技术，基本原理类似于DNA的天然复制过程，由变性--退火--延伸三个基本反应步骤构成。该方法一改传统分子克隆技术的模式，不通过活细胞，操作简便，在数小时内可使几个拷贝的模板序列甚至一个DNA分子扩增10⁷～10⁸倍，大大提高了DNA的得率。因此，现已广泛应用到分子生物学研究的各个领域。

sanger测序是第一代测序，它是使用的链终止法。Sanger测序作为30多年来惟一的DNA测序方法,对现代生物学研究起到了极大的促进作用。高通量低成本齐头并进以高通量低成本为主要特征的第二代测序,不再需要大肠杆菌进行体内扩增,而是直接通过聚合酶或者连接酶进行体外合成测序。根据其原理又可分为两类:聚合酶合成测序和连接酶合成测序。基于新一代测序的分子诊断市场是近年来临床诊断领域发展的热点，是体外诊断市场中发展速度最快的市场。随着老年人口的增加，医疗模式的转变，社会市场对测序分子诊断市场的需求不断增加，伴随着相关企业市场扩张和自身创新的需求，测序分子诊断市场面临前所未有的发展机遇。

等温扩增技术主要是基于恒定温度进行核酸扩增反应，克服了PCR扩增需要专用设备的方式。目前等温扩增的方法有多种，根据原理可以分为两种。第一类是反应依赖于特异性引物延伸的等温扩增技术；第二类是第一步反应依赖于限制性内切酶的等温扩增技术。目前使用较多的是第一种扩增技术，主要包括如依赖核酸序列的扩增、链置换扩增、滚环扩增、环介导恒温扩增、解旋酶依赖的扩增等多种恒温扩增技术。

上述列举的分子生物学检测技术，在进行检测之前都需要提取核酸，然后进行检测。都是通过直接或者间接的技术和方法使被检测的核酸分子能够在体外进行放大，从而实现检测。上述分子生物学技术都检测生命循环过程的一种靶标物质，DNA或者RNA。检测的目的，究其根本是为了确定检测靶标DNA或者RNA的有无和多少。目前的病原体检测，都是基于病原体主要遗传物质进行检测，如乙肝病毒核酸检测主要是针对乙型肝炎病毒的DNA，而人类免疫缺陷病毒核酸检测主要是针对人类免疫缺陷病毒的RNA，这些的检测目的都是通过检测主要的遗传物质实现对感染病原体的有无和多少进行确认。

发明内容

为进一步提高样本中核酸的检测灵敏度，本发明提供一种通过等温扩增技术检测样品中核酸的方法，在所述方法种采用含逆转录酶和DNA聚合酶的等温扩增体系检测DNA为遗传物质的样品，所述方法包括以下步骤：步骤1：同时提取所述样品中DNA和RNA；步骤2：在核酸扩增液中等温扩增提取的DNA和RNA，所述核酸扩增液包括逆转录酶和用于等温扩增的DNA聚合酶，所述逆转录酶将提取的RNA逆转录反应生成cDNA和所述DNA聚合酶等温扩增反应提取的DNA和逆转录的cDNA；和步骤3：对核酸扩增产物进行检测。

在一种实施方式中，步骤2中在同一个温度下完成逆转录和核酸等温扩增反应。

在一种实施方式中，在步骤2中先在一温度下完成逆转录反应，然后在另一温度下完成核酸扩增反应。