[发明专利]一种中国被毛孢原生质体的制备及再生方法

说明书

本发明涉及一种中国被毛孢原生质体制备与再生方法，所述方法是通过以氯化钾溶液为渗透压稳定剂，以商品酶Driselase from Basidiomycetes sp，Lysing Enzyme from Trichoderma harizianum和Yatalase作为复合酶进行酶解，能够制备得到含量高的中国被毛孢原生质体并成功再生，同时通过优化再生培养基实现原生质体再生时间的缩短，且操作简单，便于推广实施，具有较好应用前景。

(一)技术领域

本发明涉及一种中国被毛孢原生质体的制备及再生方法。

(二)背景技术

冬虫夏草(Cordyceps sinensis(Berk.)Sacc.)简称虫草，是子囊菌门(Ascomycota)，核菌纲(Pyrenomycetes)，麦角菌目(Clavicipitales)，麦角菌科(Clavicipitaceae)，虫草属(Cordyceps)的一种真菌。虫草菌通过侵染鳞翅目蝙蝠蛾科昆虫的幼虫，以其体内的有机物质作为营养和能量的来源进行寄生生活，经过不断生长发育和分化后，最终菌丝体扭结并形成伸出寄主外壳的子座，与幼虫尸体形成复合体，从而构成了冬虫夏草。现代药理学已证实，冬虫夏草具有免疫调节、抗菌、抗肿瘤、抗氧化、抗衰老、降血糖血脂、性激素样作用等广泛的生物活性。

冬虫夏草菌是一种子囊菌，在其生活史中具有分生孢子阶段(无性型)和子囊孢子阶段(有性型)。经过多年争论，2005年10月，中国菌物学会在北京召开了《冬虫夏草及其无性型研讨会》，确定中国被毛孢(Hirsutella sinensis)为冬虫夏草唯一无性型菌种。中国被毛孢人工发酵培养得到的菌丝经药理学和毒理学等研究，均证明与天然虫草化学组成、药理作用基本一致，可替代天然虫草生产虫草制品，以弥补自然资源的短缺。

现今中国被毛孢已经可以成功培育，但产量不高，其中一个制约因素是中国被毛孢生长条件苛刻，是一种生长缓慢周期长的低温菌，极大的限制了人工培育的发展。因此，对中国被毛孢进行内部研究和改造势在必行，而构建一套完整高效的中国被毛孢原生质体制备与再生体系不仅可以为菌株诱变筛选和原生质体融合的实现提供条件，还可以为中国被毛孢转化体系的构建和组学的进一步研究提供基础。

现有的技术中没有一整套完整高效的原生质体制备与再生体系，难以满足后续研究的需求。

(三)发明内容

本发明目的是针对现有技术的不足，提供一种中国被毛孢原生质体的制备及再生方法。

本发明采用的技术方案是：

一种中国被毛孢原生质体的制备及再生方法，所述方法包括：

(1)菌丝的培养与纯化：取中国被毛孢菌丝体，接种于种子培养基中，于11～26℃、60～200rpm转速下培养15～30天，再转接于发酵培养基中，于11～26℃、60～200rpm转速下培养3～12天，在离心机6000～10000rpm下用0.4～1.0mol/L氯化钾溶液洗涤菌丝2～3次，收集得到纯化后的菌丝体；

(2)原生质体的制备：向步骤(1)所得中国被毛孢菌丝体中加入复合酶液，于16～30℃、80～150rpm下酶解0.5～3h，过滤菌丝收集原生质体，在离心机3000～5000rpm下用0.6～1.0mol/L氯化钾溶液洗涤原生质体2～3次，将原生质体重悬于0.6～1.0mol/L氯化钾溶液中；所述复合酶液为以0.4～1.0mol/L氯化钾溶液作为渗透压缓冲液，配制的Driselase from Basidiomycetes sp.,Lysing Enzyme from Trichoderma harizianum和Yatalase分别为1000～2000U/L，5000～20000U/L和3000～10000U/L的混合溶液；