[发明专利]一种用于检测睾酮素的ELISA试剂盒的制备方法

权利要求书

1.一种用于检测睾酮素的ELISA试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括孔板、框架、吸水纸、滴管、试剂，其中，所述孔板中包被睾酮半抗原与鸡卵清蛋白偶联得到的完全抗原，所述试剂包括睾酮单克隆抗体、辣根过氧化酶标记羊抗鼠抗体、睾酮标准溶液、底物液、显色液、终止液、浓缩洗涤液。

2.根据权利要求1所述的ELISA试剂盒，其特征在于，所述底物液由醋酸钠、柠檬酸、双氧水配制而成。

3.根据权利要求1所述的ELISA试剂盒，其特征在于，所述显色液为乙二胺四乙酸。

4.根据权利要求1所述的ELISA试剂盒，其特征在于，所述终止液为硫酸溶液。

5.根据权利要求1-4任一所述的ELISA试剂盒，其特征在于，所述浓缩洗涤液为含吐温-80的磷酸盐缓冲液。

6.权利要求1所述ELISA试剂盒的制备方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：

(1)睾酮标准品肟化后得到睾酮半抗原；

(2)将步骤(1)中的睾酮半抗原与鸡卵清蛋白偶联得到睾酮包被抗原，将步骤(1)中的睾酮半抗原与牛血清蛋白偶联得到睾酮免疫抗原；

(3)利用步骤(2)中的睾酮免疫抗原免疫小鼠得到睾酮特异性单克隆抗体；

(4)将步骤(2)中的睾酮包被抗原包被在孔板上。

7.根据权利要求6所述试剂盒的制备方法，其特征在于，步骤(1)包括以下步骤：

将睾酮标准品溶于无水吡啶，加入睾酮标准品1.5-2倍物质的量的羧甲基羟胺半盐酸，45-55℃搅拌反应30-40min，减压蒸馏去吡啶；残余物用乙酸乙脂溶解，加水洗涤，取上层油样，加入无水硫酸钠干燥，减压蒸馏去乙酸乙脂，残余物用乙醚重结晶捣碎得到睾酮半抗原。

8.根据权利要求6所述试剂盒的制备方法，其特征在于，步骤(2)包括以下步骤：

A液：睾酮半抗原用N，N二甲基甲酰胺搅拌溶解，加入三乙胺，3-5℃下反应1-1.5h，加人氯甲酸异丁脂，继续反应l-1.5h；

B液：BSA、OVA分别溶于磷酸盐缓冲液中，加入N，N二甲基甲酰胺，3-5℃下搅拌反应1-1.5h；

制备A液和B液，将A液逐滴滴加在B液中，3-5℃条件下反应4-5h；先后用磷酸缓冲液和蒸馏水透析2-2.5d，期间多次换液，冷冻干燥保存。

9.根据权利要求6所述试剂盒的制备方法，其特征在于，步骤(4)包括以下步骤：

用碳酸盐缓冲液稀释睾酮包被抗原，滴加在孔板中，35-40℃孵育2-3h后倒去包被液，洗涤液清洗后拍干，封闭液滴加在孔板中，35-40℃孵育2-3h后洗涤拍干，其中，所述封闭液为牛血清蛋白溶液。

10.权利要求1所述试剂盒的检测方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：

将标准品或样品加入孔板，后加入睾酮单克隆抗体，35-40℃孵育1-1.5h后洗涤拍干，每孔加入酶标二抗，35-40℃孵育30-40min后洗涤拍干，每孔先后加入底物液和显色液，15-20min后加终止液，轻轻振荡混匀，设定酶标仪于450nm处测定每孔OD值。