[发明专利]一种提高蛹虫草中虫草多糖含量的方法

权利要求书

1.一种提高蛹虫草中虫草多糖含量的方法，其特征在于所述方法为：将过表达目的基因的蛹虫草重组菌接种至发酵培养基中，22～25℃，120～180rpm，摇床培养，获得含虫草多糖的发酵液；所述发酵培养基质量组成：2％葡萄糖，0.70％(NH₄)₂SO₄，0.05％K₂HPO₄·3H₂O，0.05％KH₂PO₄，0.05％MgSO₄·7H₂O，0.10％L-甘氨酸，溶剂为蒸馏水，pH自然；所述目的基因为葡萄糖激酶基因gk；

所述过表达目的基因的蛹虫草重组菌按如下方法制备：利用-Uni SeamlessCloning and Assembly Kit将目的基因片段与载体PCAMBIA-PgpdA-Tcbh1-hph-PtrpC链接，得到重组载体PCAMBIA-PgpdA-gk-Tcbh1-hph-PtrpC；将重组载体加入到大肠杆菌DH 5α感受态中，抽提质粒DNA，转化根癌农杆菌，获得含目的基因的农杆菌菌液；将无菌纤维素薄膜密贴合在共培养固体培养基表面，然后将蛹虫草孢子悬液与含目的基因的农杆菌菌液等体积混合，涂布于无菌纤维素薄膜上，24℃恒温避光共培养48h后，将混合菌液连同纤维素薄膜转移至选择培养基，纤维素薄膜紧密贴合无气泡，在贴合紧密的纤维素薄膜表面倒上一层选择培养基，完全覆盖纤维素薄膜，22～25℃恒温避光培养；取穿透上层选择培养基的菌丝转接至传代培养基中，22～25℃恒温避光培养3～4d，筛选获得过表达目的基因的蛹虫草重组菌；所述共培养固体培养基为IM+200mmol·L^-1乙酰丁香酮；所述选择培养基是IM+200mg·L^-1潮霉素B+200mg·L^-1头孢菌素+100mg·L^-1卡那霉素；所述传代培养基是沙氏培养基+200mg·L^-1潮霉素B。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于所述葡萄糖激酶基因gk核苷酸序列如SEQ IDNO.1所示。

3.如权利要求1所述的方法，其特征在于所述蛹虫草孢子悬液浓度为10⁶～10⁸·mL^-1。

4.如权利要求1所述的方法，其特征在于所述蛹虫草孢子悬液按如下方法制备：将蛹虫草(Cordyceps militaris)接种至PDA培养基，24℃恒温避光培养7日，然后于超净工作台上用无菌水反复冲洗PDA培养基表面，得到蛹虫草菌悬液，4层纱布过滤菌悬液除去菌丝体，得到蛹虫草孢子悬液。

5.如权利要求1所述的方法，其特征在于所述含目的基因的农杆菌菌液OD600＝0.80。

6.如权利要求1所述的方法，其特征在于所述含目的基因的农杆菌菌液按如下方法制备：将目的基因的农杆菌划线接种至固体细菌培养基，28℃恒温培养48h，再挑取单菌落接种至液体细菌培养基，180rpm、28℃恒温培养36h，然后将其接种到农杆菌预培养液体培养基中，180rpm、28℃恒温培养6～8h至菌体浓度OD600＝0.80，得到农杆菌菌液；所述固体细菌培养基是LB固体+25mg·L^-1利福平+50mg·L^-1Kan卡那霉素；所述液体细菌培养基为LB液体+25mg·L^-1利福平+50mg·L^-1卡那霉素；所述农杆菌预培养液体培养基是IM+200mmol·L^-1乙酰丁香酮。

7.如权利要求1所述的方法，其特征在于所述农杆菌为根癌农杆菌(Agrobacteriumtumefaciens)AGL-1。