[发明专利]一种提高蛹虫草中虫草多糖含量的方法

说明书

本发明公开了一种提高蛹虫草中虫草多糖含量的方法，所述方法为：将含目的基因的蛹虫草重组菌接种至发酵培养基中，22～25℃，120～180rpm，摇床培养，获得含虫草多糖的发酵液；所述目的基因为葡萄糖激酶基因gk、磷酸葡萄糖变位酶基因pgm或焦磷酸化酶基因ugp。本发明通过转基因技术获得了蛹虫草的基因突变菌株，该突变菌株与原始型菌株相比，其发酵液中虫草多糖的产量为1.35倍，为进一步筛选蛹虫草的优良品种打下了基础。

(一)技术领域

本发明涉及蛹虫草栽培领域，具体涉及一种提高蛹虫草中虫草多糖含量的方法。

(二)背景技术

作为传统中药，虫草的研究和应用一直备受关注。虫草是由子囊菌门(Ascomycoa)，肉座菌目(Hypocreales)，麦角菌科(Clavicipitaceae)，虫草属(Cordyceps)真菌的孢子寄生于昆虫幼虫身上并由夏季从虫体生出子实体所形成的菌虫复合体。其中最著名的是寄生于高山蝙蝠蛾(Hepialusarmoricanus)幼虫的冬虫夏草(Ophiocorducepssinensis)和寄生于鳞翅目蛹的蛹虫草(Cordyceps militaris)。但是C.militaris不同于O.sinensis的地方在于C.militaris的子实体更易于培养，是冬虫夏草(Cordyceps)模式菌株，所以常被科研团队作为虫草各方面特性的主要研究对象。虫草产生的天然活性成分如甘露醇、核苷、氨基酸、麦角甾醇、虫草酸、虫草素、虫草多糖(CP)等对多种机体有很高的药用价值，尤其是据报道虫草多糖有很好的保护肾脏、肝脏，降低血糖，抗菌、抗炎、抗肿瘤、抗心律失常，提高机体免疫，减轻机体疲劳的功效。虫草多糖基于单糖组成被划分为两个不同的类别，同多糖(homo-CPS)和杂多糖(hetero-CPS)。但是由于不计后果的开采，地理限制和不利的天气条件等因素的影响，野生或天然来源的虫草变得越来越稀缺，因此虫草菌丝体的大规模培养生产虫草多糖作为一种用途广泛的新药来开发是必然的趋势。

gk、pgm、ugp是蛹虫草体内将葡萄糖反应生成活化核苷酸糖的代谢路径上的三个基因，其在蛹虫草基因组序列中已经得到确证。在蛹虫草细胞内扩增gk、pgm、ugp基因，将其导入野生型蛹虫草基因组DNA中，利用强力启动子过表达目的基因提高虫草多糖产量。

过表达蛹虫草合成多糖的基因以提高蛹虫草多糖产量尚未有文献报道。

(三)发明内容

本发明目的是提供一种提高蛹虫草中虫草多糖含量的方法，该方法通过转基因技术获得了蛹虫草的基因突变菌株，该突变菌株与原始型菌株相比，其发酵液中虫草多糖的产量为1.35倍，为进一步筛选蛹虫草的优良品种打下了基础。

本发明采用的技术方案是：

本发明提供一种提高蛹虫草中虫草多糖含量的方法，所述方法为：将含目的基因的蛹虫草重组菌接种至发酵培养基中，22～25℃，120～180rpm，摇床培养，获得含虫草多糖的发酵液；所述发酵培养基质量组成：2％葡萄糖，0.70％(NH₄)₂SO₄，0.05％K₂HPO₄·3H₂O，0.05％KH₂PO₄，0.05％MgSO₄·7H₂O，0.10％L-甘氨酸，溶剂为蒸馏水，pH自然；所述目的基因为葡萄糖激酶(glucokinase)基因gk、磷酸葡萄糖变位酶(phosphoglucomutase)基因pgm或焦磷酸化酶(pyrophosphorylase)基因ugp。

进一步，所述葡萄糖激酶基因gk核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；磷酸葡萄糖变位酶基因pgm核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；焦磷酸化酶基因ugp核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。