[发明专利]核酸的标记方法

说明书

一种核酸的标记方法，包括以下步骤：反应步骤，将核酸探针杂交至标记对象的核酸，其中，所述核酸探针具有与标记对象的核酸互补的碱基序列，并且在与所述标记对象的核酸的成为标记靶的靶碱基互补的位置导入有反应性碱基衍生物；转移步骤，将包含在所述反应性碱基衍生物的转移基团转移至所述标记对象的核酸的包含所述靶碱基的核苷酸残基；以及标记步骤，用放射性物质对转移至所述核苷酸残基的所述转移基团进行标记。

技术领域

本发明涉及核酸的标记方法。

背景技术

反义药物、适体药物及siRNA药物等的核酸药物，基于形成DNA或RNA的短片段与疾病相关基因RNA的特异性的碱基配对发挥作用。核酸药物不仅可以靶向编码蛋白质的RNA，而且还可以靶向非编码区域。作为不能用小分子及抗体药物治疗的疾病的治疗药物，根据核酸药物的药物开发已经展开，并且已经对遗传性疾病及癌症等的顽固性疾病进行了许多临床研究。

为了防止在活体内的酶水解，被实用化的反义药物由许多化学修饰剂组成。源自该化学修饰剂的副作用或毒性成为大课题。相对于反义药物包含许多化学修饰剂，由于作用机理，siRNA的成分多是天然核酸。因此，为了避免生物降解，siRNA药物封装在药物输送系统(DDS)中使用。然而，DDS可能会成为毒性的原因，因此避免不仅源自siRNA而且源自DDS的毒性已经成为一个问题。

对于小分子药物，从开发阶段就研究其药物动力学，并研究提高药效的同时避免毒性。与小分子药物的开发相比较，核酸药物的动力学分析还不充分。这是由于核酸药物的分子量很大通常高达几千Da以上，并且代谢物的结构多样化，因此不能适用质谱法及HPLC分析等。特别是在siRNA药物的情况下，摄入siRNA反义链的活性化RNA诱导沉默复合体(RNAInduced Silencing Complex；RISC)以极低浓度在细胞内发挥作用。作为动力学分析对象的核酸，往往成为低于检测极限的极低浓度。

由于放射性以高灵敏度可检测，因此不仅可以用于在体内(in vivo)实验，还具有可以用于例如PET(positron emission tomography，正电子发射体层显像)及SPECT(single photon emission computed tomography，单光子发射计算机断层显像)在人体内的核酸追踪的可能性。

用放射性标记的核酸，即、放射标签化核酸包括标记核酸的碱基序列的末端的末端标签体(label body)、和标记末端以外的部位的内部标签体。非专利文献1～6公开了末端标签体。在末端标签体的情况下，当核酸在活体内被分解成片段时，只能检测包含以放射性标记的末端的片段。因此，末端标签体适合于如上所述抑制了降解的反义药物的动力学研究。

另一方面，许多天然核酸作为成分的siRNA的情况下，除了易于通过酶水解而片段化以外，未摄入至活性化RISC中的正义链在产生活性化RISC的过程中被分解并代谢。因此，为了检测siRNA向活性化RISC中的摄入和其动力学，需要选择性地放射性标记核酸的期望位置的内部标签体。

通过使用补骨脂素等的光反应剂或聚合酶，可以获得内部标签体。然而，可以用光反应剂或聚合酶标记的核酸上的位置是随机的，不能选择性地放射性标记核酸的期望位置。

非专利文献7～10报告了内部标签体。这些内部标签体，无论哪一个都在核酸合成阶段掺入标签化前驱体，并在核酸合成后导入放射性元素。非专利文献7公开了一种方法，在该方法中，在使用了核酸合成装置的固相法的核酸的合成中，将核糖的5位羟基氧化，并用具有氚的硼氢化钠还原。

非专利文献8公开了一种方法，在该方法中，将在siRNA的合成阶段掺入的溴尿嘧啶具有的Br在加压下与氚气反应，以替换为氚。放射性元素不限于氚。例如，在非专利文献9中，使用碘的同位素。另外，在非专利文献10中，包含铟同位素的金属络合物被导入核酸。

现有技术文献

非专利文献