[发明专利]用于解决基因检测中荧光定量PCR非特异性扩增干扰的方法

说明书

本发明公开一种用于解决基因检测中荧光定量PCR非特异性扩增干扰的方法，其特征在于，包括：PCR扩增反应条件为：90—95℃预变性1—15min；90—95℃变性10—30s；50—65℃退火30s—90s；70—85℃延伸10s—30s；35‑50个循环；信号收集设置在延伸环节。本发明采用三步法扩增，将荧光定量信号收集过程设定在延伸阶段，既有效避免了非特异性扩增信号的干扰，又省去了熔解曲线的构建过程，缩短了反应时间，提高了检测准确性，适用于多数荧光定量PCR反应实验，对于提高PCR扩增反应实验效率具有重要意义。

技术领域

本发明涉及分子生物学领域，特别是涉及一种用于解决基因检测中荧光定量PCR非特异性扩增干扰的方法。

背景技术

荧光定量PCR技术是一种定量PCR检测技术，通过荧光染料或荧光标记的特异性探针，对PCR扩增产物进行标记跟踪，实时在线监控反应过程，再结合相应的软件对产物进行分析，计算出模板的初始浓度。荧光定量PCR 技术根据标记方法的不同，常用的有荧光染料法和水解探针法。

荧光染料法是在PCR反应体系中，加入过量的SYBR Green等荧光染料， SYBRGreen荧光染料能够非特异性地掺入DNA双链后，发射荧光信号，而不掺入链中的SYBRGreen染料分子不会发射任何荧光信号，从而保证荧光信号的增加与PCR产物的增加完全同步，以此来监控PCR反应的进行。荧光染料法实时定量PCR技术适用性强，成本低，使用简便，但是由于SYBR Green等染料是非特异性的掺入到所有扩增出的DNA双链片段中，就不可避免的会导致一些非特异性扩增的片段被染料掺入后产生荧光信号干扰检测。

而目前用于基因检测过程中常常是用一步法或者两步法进行PCR扩增，需要全程收集荧光信号，并且不可避免的会产生二聚体等非特异性扩增信号造成干扰，还需要对检测的结果根据反应时间和荧光信号的变化绘制熔解曲线，过程繁琐，反应时间长，并且检测准确性低。而如何针对目前的技术问题进行改进获取一种方便操作、缩短反应时间且能提高检测准确性的方法具有重要的现实意义。

发明内容

本发明的目的是提供一种用于解决基因检测中荧光定量PCR非特异性扩增干扰的方法，采用三步法扩增，将荧光定量信号收集过程设定在延伸阶段，既有效避免了非特异性扩增信号的干扰，又省去了熔解曲线的构建过程，缩短了反应时间，提高了检测准确性。

为实现上述目的，本发明提供了如下方案：

本发明提供一种用于解决基因检测中荧光定量PCR非特异性扩增干扰的方法，包括：PCR扩增反应条件为：90—95℃预变性1—15min；90—95℃变性10—30s；50—65℃退火30s—90s；70—85℃延伸10s—30s；35-50 个循环；信号收集设置在延伸环节。

优选的是，还包括：20μL PCR反应体系；

所述20μL PCR反应体系包括以下组分：2×SYBR Green I PCR Master Mix 10μL，特异性引物对各0.4μL，DNA模板10—100ng，ddH₂O补充至 20μL。

优选的是，所述特异性引物对包括以下7对引物对中任意一对：

引物对1：

上游引物序列如SEQ ID NO.1所示；

下游引物序列如SEQ ID NO.2所示；

引物对2：

上游引物序列如SEQ ID NO.3所示；

下游引物序列如SEQ ID NO.2所示；

引物对3：

上游引物序列如SEQ ID NO.4所示；