[发明专利]肠道集聚性大肠杆菌DNA提取方法及其标准品的应用在审
| 申请号： | 202010135698.3 | 申请日： | 2020-03-02 |
| 公开（公告）号： | CN111235144A | 公开（公告）日： | 2020-06-05 |
| 发明（设计）人： | 陈蕾蕾;杨金玉;陈相艳;王易芬;杨焕蝶;辛雪;周庆新;赵双枝;裘纪莹 | 申请（专利权）人： | 山东省农业科学院农产品研究所 |
| 主分类号： | C12N15/10 | 分类号： | C12N15/10;C12Q1/689;C12Q1/10 |
| 代理公司： | 北京智桥联合知识产权代理事务所(普通合伙) 11560 | 代理人： | 江莉莉 |
| 地址： | 250100 山东*** | 国省代码： | 山东;37 |
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| 摘要： | |||
| 搜索关键词： | 肠道 集聚 大肠杆菌 dna 提取 方法 及其 标准 应用 | ||
1.一种肠道集聚性大肠杆菌基因组DNA提取方法，其特征在于，在裂解菌体前，使用溶菌酶处理培养的菌液。
2.根据权利要求1的肠道集聚性大肠杆菌基因组DNA提取方法，其特征在于，采用溶菌酶处理时每毫升菌液使用3～5毫克溶菌酶处理，于35～40℃下处理35～45min；优选的，采用溶菌酶处理时每毫升菌液使用4毫克溶菌酶处理，于37℃下处理40min。
3.根据权利要求1的肠道集聚性大肠杆菌基因组DNA提取方法，其特征在于，其中裂解菌体时每毫升菌液使用0.7～0.9毫克蛋白酶K，55℃下处理30min；
优选的，其中裂解菌体时每毫升菌液使用0.8毫克蛋白酶K，50～60℃下处理25～35min。
4.根据权利要求3中任一项的肠道集聚性大肠杆菌基因组DNA提取方法，其特征在于，提取使用全式金细菌基因组DNA提取试剂盒EE161-01或TaKaRa细菌基因组DNA提取试剂盒9763。
5.根据权利要求4的肠道集聚性大肠杆菌基因组DNA提取方法，其特征在于，提取使用全式金细菌基因组DNA提取试剂盒EE161-01。
6.根据权利要求5的肠道集聚性大肠杆菌基因组DNA提取方法，包括以下的步骤：
（1）取1mL过夜培养的肠道集聚性大肠杆菌菌悬液，离心弃上清后加入含溶菌酶4 mg的200 μL重悬缓冲液；于35～40℃下孵育35～45min，离心，去上清；
（2）在（1）中去上清后的产物中加入100 µL裂解缓冲液和40 µL 20mg/mL的蛋白酶 K溶液；50～60℃下孵育25～35min；孵育结束后加入20 µL RNase A混匀静置10 min；（3）在（2）中静置的产物中加入400 µL结合缓冲液，涡旋30s；重复前面步骤，通过离心收集3份1mL菌体制备的裂解液到同一离心柱中；经过漂洗、洗脱得到基因组DNA。
7.根据权利要求1-6任一项的肠道集聚性大肠杆菌基因组DNA提取方法在制备肠道集聚性大肠杆菌核酸检测标准品的应用。
8.根据权利要求1-6任一项的肠道集聚性大肠杆菌基因组DNA提取方法所制备的肠道集聚性大肠杆菌基因组DNA产品。
9.根据权利要求8的肠道集聚性大肠杆菌基因组DNA产品作为肠道集聚性大肠杆菌核酸检测标准品的应用。
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