[发明专利]肠道集聚性大肠杆菌DNA提取方法及其标准品的应用

说明书

本发明属于核酸标准物质制备和分子生物学检测领域，具体地涉及一种肠道集聚性大肠杆菌基因组DNA提取方法，以及上述的肠道集聚性大肠杆菌基因组DNA方法在制备肠道集聚性大肠杆菌核酸检测标准品的应用。本发明提供了一种肠道集聚性大肠杆菌基因组DNA提取方法，最大的特点是，在裂解菌体前，使用溶菌酶处理培养的菌液，且在裂解前使用溶菌酶处理菌体并在裂解过程中使用大量蛋白酶K处理。本发明为大量制备核酸定性标准样品的提取工作奠定了基础，同时也为基因组DNA提取困难的细菌基因组DNA的提取方法提供了参考。

技术领域

本发明属于核酸标准物质制备和分子生物学检测领域，具体地涉及一种肠道集聚性大肠杆菌基因组DNA提取方法，以及上述的肠道集聚性大肠杆菌基因组 DNA方法在制备肠道集聚性大肠杆菌核酸检测标准品的应用。

背景技术

致泻性肠杆菌是细菌性食物中毒的主要致病菌，也是引起感染性腹泻的主要病因，致泻性肠杆菌可分为5类，即肠产毒性大肠杆菌(Enterotoxigenic E.coli，ETEC)、肠侵袭性大肠杆菌(Enteroinvasive E.coli，EIEC)、肠致病性大肠杆菌(EnteropathogenicE.coli，EPEC)、肠出血性大肠杆菌(Enterohemorrhagic. coli，EHEC)及肠集聚性大肠杆菌(Enteroaggregative E.coli，EAEC)，EAEC 在1987年被首次报道，首次分离于一智利患有顽固性腹泻的儿童体内，是一类新型的致泻性大肠杆菌，EAEC不侵入肠道上皮细胞，但能引起肠道液体蓄积，不产生热稳定性肠毒素，不产生热不稳定性肠毒素，也不产生志贺毒素，唯一的特点是能对Hep-2细胞形成集聚性黏附，也称Hep-2细胞粘附性大肠埃希菌，EAEC 形态上与一般大肠杆菌无异，为革兰氏阴性短杆菌，最适生长温度37℃下，无特殊的营养要求。

EAEC以食物或水为主要传播媒介，通过粪口途径传播，人类普遍易感，成年人的中毒症状表现为中度腹泻，婴幼儿感染后多表现为2周以上的持续性腹泻。除肠产毒性大肠杆菌感染外，EAEC也是旅行者腹泻的主要原因，目前EAEC已在世界范围内由散发转为暴发流行。食源性致病菌引起严重的食品安全问题，使得公共卫生安全受到严重的威胁，科学、快速、准确地检测食源性病原菌是防预和控制食源性疾病引起的食品安全问题的重要手段，相较于传统的微生物学培养方法，灵敏度高、特异性强、耗时短、适用范围广的聚合酶链反应(PCR)得到广泛应用，然而用作PCR检测的阳性对照或定量标准的食品微生物类参考物质在全球范围内整体较为匮乏，在参考物质资源共享平台上适用于食品微生物检测的参考物质较少，基本停留在由菌种保藏机构提供纯种的阶段。因此建立食源性病原菌检测用核酸参考物质是改变该类参考物质匮乏现状的关键方法。在EAEC基因组DNA提取过程中发现，EAEC与一般大肠杆菌不同，其菌体不易裂解，并且其菌体裂解液粘稠度远大于其它大肠杆菌，造成EAEC的基因组DNA提取较为困难，其核酸参考物质制备不能使用目前市面上提供的细菌基因组提取试剂盒直接提取。目前，对EAEC基因组DNA提取和核酸参考物质的制备尚无专门的研究。

发明内容

为了解决上述的技术问题，本发明主要通过比较多种试剂盒对EAEC基因组 DNA的提取效果，并对其中的TaKaRa及全式金细菌基因组DNA提取试剂盒进行优化，借此提高EAEC基因组DNA的提取量，为食品微生物类核酸参考物质研发中前期样品的制备提供一种高效的提取方法。

一方面，本发明提供了一种肠道集聚性大肠杆菌基因组DNA提取方法，最大的特点是，在裂解菌体前，使用溶菌酶处理培养的菌液，且在裂解前使用溶菌酶处理菌体并在裂解过程中使用大量蛋白酶K处理。

进一步地，采用溶菌酶处理时每毫升菌液使用3～5毫克溶菌酶处理，于35～ 40℃下处理35～45min；优选的，采用溶菌酶处理时每毫升菌液使用4毫克溶菌酶处理，于37℃下处理40min。

进一步的，其中裂解菌体时每毫升菌液使用0.7～0.9毫克蛋白酶K，55℃下处理30min；