[发明专利]一种用于布鲁氏菌RPA扩增的引物组、可视化检测试剂盒及应用

说明书

本发明提供了一种用于布鲁氏菌RPA扩增的引物组、可视化检测试剂盒及应用，属于分子生物学检测技术领域；所述引物组包括上游引物和下游引物。利用本发明的引物组对布鲁氏菌进行RPA扩增，结合SYBR Green I可对布鲁氏菌进行现场可视化检测，本发明不依赖PCR仪等热循环仪器，利用RPA技术对布鲁氏菌核酸进行扩增，扩增结束后使用395nm波长的紫外灯进行照射，观察反应体系是否呈现荧光判定检测结果，本发明的引物组具有特异性强、敏感性好，所发明的试剂盒操作简单、检测快速、结果可视化等优点，为布鲁氏菌的现场可视化检测提供新的方法。

技术领域

本发明涉及分子生物学技术领域，尤其涉及一种用于布鲁氏菌RPA扩增的引物组、可视化检测试剂盒及应用。

背景技术

布鲁氏菌(Brucella)又称布氏杆菌，是一种革兰氏阴性的不运动细菌，可以在牛、羊、猪等多种家畜体内存活。

目前我国对布鲁氏菌的检测主要以细菌学、血清学检测方法为主，这些方法存在着费时费力，假阳性等缺点。随着分子生物学技术的发展，PCR方法逐步用于布鲁氏菌的鉴定。但PCR技术本身存在依赖PCR仪、易污染、灵敏度和特异性有待于进一步提高等问题，而且扩增产物需要经过进一步琼脂糖凝胶电泳或荧光定量检测等设备才能得到检测结果，不能实现布鲁氏菌的可视化检测。

发明内容

本发明的目的在于提供一种用于布鲁氏菌RPA扩增的引物组、可视化检测试剂盒及应用，本发明的方法具有特异性强、灵敏度高、能够可视化检测的优点。

为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

本发明提供了一种用于布鲁氏菌RPA扩增的引物组；所述引物组包括上游引物和下游引物；所述上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；所述下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

本发明提供了一种包括上述方案所述引物组的试剂盒。

优选的，所述试剂盒还包括醋酸镁水溶液、RPA反应缓冲液、RPABasic冻干粉、50×SYBR Green I和无菌水。

优选的，所述试剂盒还包括阳性对照品和阴性对照品；所述阳性对照品包括布鲁氏菌的基因组DNA；所述阴性对照品包括无菌水。

本发明提供了上述方案所述引物组或者所述试剂盒在非诊断目的的布鲁氏菌RPA扩增中的应用，所述应用包括以下步骤：

1)提取待检测样品的基因组DNA；

2)以待检测样品的基因组DNA为模板，利用上述方案所述引物组进行RPA扩增反应，得到RPA扩增产物；

3)将所述RPA扩增产物和50×SYBR Green I混合，离心，用395nm波长的紫外灯照射，观察扩增产物的产生荧光情况，若扩增产物呈现荧光，则样品中含有布鲁氏菌，若扩增产物不呈现荧光，则样品中不含布鲁氏菌。

优选的，步骤2)中还包括分别以布鲁氏菌的基因组DNA和无菌水为模板进行RPA扩增；所述以布鲁氏菌的基因组DNA为模板的RPA扩增结果作为阳性对照，以无菌水为模板的RPA扩增结果作为阴性对照。

优选的，步骤2)中所述RPA扩增反应的反应体系以50μL计包括：2μL模板、12.4μL无菌水、29.5μL RPA反应缓冲液、上下游引物各1.8μL，2.5μL醋酸镁水溶液和4mg RPABasic冻干粉；

所述醋酸镁水溶液中醋酸镁的浓度为280mM；所述上游引物和下游引物的浓度分别为10μM；所述模板的浓度为0.1μg/μL。

优选的，步骤2)中所述RPA扩增反应的程序为：37～42℃扩增10～20min。

优选的，以RPA扩增的扩增体系为50μL计，步骤3)中所述50×SYBR Green I的用量为1～2μL。