[发明专利]一种苹果花叶病的检测方法

权利要求书

1.一种苹果花叶病的检测方法，所述苹果花叶病由李属坏死环斑病毒(PNRSV)、苹果坏死花叶病毒(ApNMV)或/和苹果花叶病毒(ApMV)所引起，该PCR检测体系中包括下述简并引物：

SEQ ID No.1：5’–GAGAGGTTGGCAGTTSGWASCYCC-3’，

SEQ ID No.2：5’–CACTYACCACTAYGTAMAWATCC-3’，

其中，S＝G/C；W＝A/T；Y＝C/T；M＝A/C；

所述的检测方法为实时荧光定量PCR检测。

2.根据权利要求1所述的PCR检测方法，所述PCR检测为10μL反应体系：SYBR反应液5.0μL，10pM/μL SEQ ID No.1、SEQ ID No.2引物溶液各0.5μL，待测苹果样品cDNA模板1.0μL，RNase-free水3.0μL。

3.根据权利要求2所述的PCR检测方法，所述待测苹果样品cDNA模板的制取方法为：提取待测苹果样品的总RNA，反转录为cDNA。

4.根据权利要求2所述的PCR检测方法，所述PCR检测的反应条件为：95℃预变性3min；94℃变性15s，60℃退火15s，40次循环，每次循环第2步进行荧光采集；最后退火至65℃，每隔30s上升0.5℃至95℃变性1min，采集荧光强度，绘制溶解曲线。

5.根据权利要求4所述的PCR检测方法，还包括判定步骤即根据溶解曲线Tm值判断带毒情况，具体为当Tm值介于81.0-83.0℃时，则待测苹果样品为苹果花叶病植株；当Tm值不在81.0-83.0℃区间，则待测苹果样品为无苹果花叶病的植株。

6.根据权利要求5所述的PCR检测方法，所述待测苹果样品来自于苹果的叶片、枝条、花或果实。

7.一种苹果花叶病的分子检测试剂盒，其特征在于，所述苹果花叶病由下述病毒中至少一种所引起：李属坏死环斑病毒(PNRSV)、苹果坏死花叶病毒(ApNMV)和苹果花叶病毒(ApMV)，该检测试剂盒包含下述两条简并引物：

SEQ ID No.1：5’–GAGAGGTTGGCAGTTSGWASCYCC-3’，

SEQ ID No.2：5’–CACTYACCACTAYGTAMAWATCC-3’，

其中，S＝G/C；W＝A/T；Y＝C/T；M＝A/C。

8.根据权利要求7所述的分子检测试剂盒，还包含SYBR反应液；其中SYBR反应液包括聚合酶、反应缓冲液和核酸染料SYBR GreenⅠ。

9.根据权利要求7所述的分子检测试剂盒，所述苹果花叶病的待测样品来自于苹果的叶片、枝条、花或果实。