[发明专利]一种苹果花叶病的检测方法

说明书

本发明公开了一种苹果花叶病的高效快速检测方法，可一次性检测苹果植株是否携带李属坏死环斑病毒(PNRSV)、苹果坏死花叶病毒(ApNMV)和苹果花叶病毒(ApMV)3种病毒。通过设计优化特异简并引物，以苹果树叶片、枝条、花或果实样本cDNA为模板，进行实时荧光定量PCR扩增反应，通过分析特定溶解曲线判断是否携带苹果花叶病，具有高兼容性和高灵敏度特点。本发明检测方法操作简单，稳定性好，适合应用于对田间采集的苹果样品进行快速检测，从而为苹果花叶病害防控措施的制定提供指导，减少病害造成的损失。

技术领域

本发明涉及植物保护领域及分子生物学检测领域，具体地说，涉及一种苹果花叶病的检测方法。

背景技术

我国是苹果生产大国，多年来种植面积和总产量均居世界首位。然而我国陕西、山东、北京等苹果产区病毒病发生普遍，不同病毒病复合侵染率达90％以上，导致减产20-30％，商品果率降低25％以上，病毒病害已成为严重影响果品产量和品质的主要因素之一。苹果树被病毒侵染后终生带毒，目前尚无有效的药剂去除。病毒在果树体内增殖，干扰、破坏树体的正常生理机能，导致长势减退，产量下降，品质变劣。其中，苹果花叶病是苹果生产中最常见的病毒性病害之一，严重制约着我国苹果产业的健康发展。为从源头杜绝苹果花叶病害，针对病毒病原进行检测，以获得无病毒接穗和无病毒苗木，成为我国苹果产业的重大技术需求。

目前，已鉴定的可导致苹果发生花叶病害的病毒主要包括李属坏死环斑病毒(Prunus necrotic ring spot virus，PNRSV)、苹果坏死花叶病毒(Apple necroticmosaic virus，ApNMV)和苹果花叶病毒(Apple mosaic virus，ApMV)。采用实时荧光定量PCR技术进行病毒核酸检测，是现今最为可靠和应用最多的方法，具有准确、灵敏、快速等突出优势。然而，由于田间苹果植株上普遍存在多种病毒复合侵染现象，利用常规检测方法只能针对单一病毒甚至单一病毒株系进行检测，逐一检测多种病毒和病毒株系不仅工作量大、成本高，而且难以兼顾病毒突变株系多的特性，容易造成漏检(即假阴性)。

针对上述苹果病毒检测中存在的问题，我们通过对GenBank数据库中已知的PNRSV、ApNMV、ApMV病毒及其突变体核酸序列的比对分析，发现该3类病毒外壳蛋白(CoatProtein，CP)的核酸序列存在保守区，适用于进行一次性检测(兼容检测)，以减少现有实时荧光定量PCR检测方法的时间、工作量和成本。由此，本发明通过设计针对该3种病毒序列保守区的特异简并引物，优化与检测引物配套的实时荧光定量PCR检测体系，建立了一种苹果花叶病的检测方法，为苹果花叶病的田间检测及无病毒苗木的繁育和检疫提供了技术保障。

发明内容

本发明的目的在于提供一种苹果花叶病的检测方法。

本方法所检测的对象为与苹果花叶病症有关的3种苹果病毒，包括李属坏死环斑病毒(PNRSV)、苹果坏死花叶病毒(ApNMV)和苹果花叶病毒(ApMV)。

所述检测方法为实时荧光定量PCR检测，该PCR检测方法中使用下述2个特异脱氧核苷酸核酸序列SEQ ID No.1、SEQ ID No.2作为简并引物，在检测体系中成对使用，SEQ IDNo.1、SEQ ID No.2序列如下：

SEQ ID No.1：5’–GAGAGGTTGGCAGTTSGWASCYCC-3’

SEQ ID No.2：5’–CACTYACCACTAYGTAMAWATCC-3’

其中，S＝G/C；W＝A/T；Y＝C/T；M＝A/C。

所述PCR检测采用10μL反应体系，包括SYBR反应液5.0μL，10pM/μL SEQ ID No.1、SEQ ID No.2引物溶液各0.5μL，待测苹果样品cDNA模板1.0μL，RNase-free水3.0μL。

所述待测苹果样品cDNA模板的制取方法为：提取待测苹果样品的总RNA，反转录为cDNA。