[发明专利]短小蛇根草OpWRKY2转录因子的编码序列及其应用

说明书

本发明提供了一种短小蛇根草OpWRKY2转录因子的编码序列及其应用，从短小蛇根草中分离克隆了1071bp的OpWRKY2转录因子的编码框序列；构建了含OpWRKY2基因的植物表达载体并遗传转化短小蛇根草茎段外植体，获得过量表达OpWRKY2基因的短小蛇根草毛状根；利用高效液相色谱法分析转基因毛状根中喜树碱的含量，结果表明过量表达OpWRKY2基因可以促进短小蛇根草毛状根中喜树碱的积累；通过qRT‑PCR分析、凝胶阻滞实验和双荧光素酶报告基因实验，发现OpWRKY2转录因子可以结合和瞬时激活喜树碱合成基因OpTDC1的表达，从而提高喜树碱的积累。本发明方法为生产具有广谱抗癌疗效的喜树碱提供了一种新型优质药源，具有重要的理论意义和潜在的应用价值。

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，涉及一种利用OpWRKY2转录因子提高短小蛇根草毛状根中喜树碱含量的方法。

背景技术

短小蛇根草(Ophiorrhiza pumila)隶属于茜草科(Rubiaceae)蛇根草属(Ophiorrhiza)，为双子叶多年生草本植物。全草均可入药，性味苦寒，具清热解毒之效，民间用来治疗高热、百日咳和外伤感染等。短小蛇根草是继喜树和青脆枝之后发现的喜树碱(Camptothecin，CPT)药源植物。喜树碱类化合物是DNA拓扑异构酶I(Topo I)的特异性抑制剂，能够抑制细胞的复制、生长与繁殖，是一类广谱的抗癌药物。临床上被用来治疗结肠癌、直肠癌、卵巢癌等。然而单一的种植模式及匮乏的种质资源严重制约了喜树碱类抗癌药物的供应，无法满足逐年增长的市场需求。所以，提高喜树碱的产量成为了近些年的研究热点，通过代谢工程技术提高植物中次级代谢产物的含量是一个行之有效的方法。近些年来转录因子作为研究热点，被广泛的报道能够参与调控植物次级代谢。

WRKY转录因子是植物中最大的转录因子家族之一，其DNA结合区包含一至两个WRKY核心结构域，该结构域的N端含有七个高度保守的氨基酸序列，即WRKYGQK，而其C端有一个特殊的锌指结构。锌指结构主要有两种形式：Cx_4-5Cx_22-23HxH和Cx₇Cx₂₃HxC。根据所含WRKY结构域的数量和锌指结构类型的不同，WRKY转录因子被划分为三类。WRKY转录因子的生物学功能具有多样性，包括：响应生物胁迫与非生物胁迫、调控植物生长发育及调控植物代谢合成等。已有研究报道WRKY转录因子在调控植物次生代谢调控过程中发挥重要作用。

发明内容

本发明提供短小蛇根草OpWRKY2转录因子的编码序列及其应用，短小蛇根草的OpWRKY2可以促进短小蛇根草毛状根中喜树碱的积累；利用qRT-PCR分析转基因毛状根中喜树碱生物合成基因的表达，发现过量表达OpWRKY2基因可以明显提高OpTDC基因的表达；通过凝胶阻滞实验和双荧光素酶报告基因实验，发现OpWRKY2转录因子可以结合和瞬时激活喜树碱合成基因OpTDC的表达。本发明还提供了一种提高短小蛇根草毛状根中喜树碱含量的方法，并解析了OpWRKY2转录因子调控喜树碱生物合成的分子机制，为生产具有广谱抗癌疗效的喜树碱提供了一种新型优质药源，具有重要的理论意义和潜在的应用价值。

本发明可以通过以下技术方案来实现：

本发明从短小蛇根草中克隆得到OpWRKY2转录因子，所述OpWRKY2转录因子的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，其基因编码框序列为1071bp；所述OpWRKY2转录因子的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。构建过表达载体，遗传转化短小蛇根草茎段获得转基因毛状根；qRT-PCR分析OpWRKY2及喜树碱生物合成相关基因在毛状根中的表达；高效液相色谱测定转基因毛状根中喜树碱的含量；利用凝胶迁移实验及双荧光素报告基因检测实验证明OpWRKY2转录因子通过结合和激活喜树碱合成的基因OpTDC1来调控喜树碱的生物合成。

本发明还提供了一种多肽，所述多肽的基酸序列如SEQ ID NO.2所示。