[发明专利]基于海藻酸钠-铂纳米粒子氧化酶活性的原花青素检测方法

权利要求书

1.一种基于海藻酸钠-铂纳米粒子氧化酶活性的原花青素检测方法，其特征是利用生物相容性好且无毒的海藻酸钠作为纳米材料的保护剂来制备海藻酸钠-铂纳米粒子，所合成的材料在温和条件下就能快速催化溶解氧产生O₂^•−并氧化3, 3’, 5, 5’-四甲基联苯胺盐酸盐产生颜色反应，并利用其良好的内在模拟氧化物酶活性对原花青素进行检测；包括显色体系在450 nm处的吸光度值随着所加入原花青素浓度的升高而明显下降；当反应体系中原花青素的浓度达到1 mmol/L时，颜色反应几乎被完全抑制；因此，原花青素是可以一定程度上抑制海藻酸钠-铂纳米粒子溶液的氧化酶催化活性，可以用肉眼观察根据显色体系溶液颜色深浅初步判断所含原花青素浓度的大小；

根据显色体系在波长450 nm处的吸光度差值ΔA₄₅₀对原花青素终浓度以10为底的对数值绘制标准工作曲线，于是，便可实现对原花青素实际样品的定量检测，所述的ΔA₄₅₀ =A₀ - A_t，其中A₀和A_t分别是不含原花青素和存在相应浓度原花青素时，反应产物在450 nm处的吸光度；标准工作曲线在原花青素浓度为4~32.5 μmol/L范围内具有很好的线性，ΔA₄₅₀ = 1.1791·lgC_OPC+ 3.1941，相关系数为0.999，在OPC浓度为10 μmol/L，n=9下相对标准偏差RSD为0.6%，最低检测限为2.0 μmol/L；

以1 mmol/L的抗坏血酸对该检测体系的抗氧化能力定义为1 U，最终检测得葡萄籽样品中原花青素的抗氧化能力为2.85 U/mg；再选取不同浓度的原花青素标准品溶液10 μmol/L、15 μmol/L、20 μmol/L，分别加入到样品溶液中并混合均匀后加入到显色体系，再重复测定步骤分别测定它们的吸光度值，并将所得吸光度代入标准曲线，得到葡萄籽样品中原花青素的加标回收率；在三个不同浓度的加标水平下，葡萄籽中原花青素的加标回收率为97.0 %至98.6 %，均在95-105 %要求的标准范围内，相对标准偏差在0.5-3.4 %范围之间。

2. 根据权利要求1所述的一种基于海藻酸钠-铂纳米粒子氧化酶活性的原花青素检测方法，其特征是所使用的海藻酸钠-铂纳米粒子由下述方法制备的：称取0.1 g海藻酸钠溶解于50 mL浓度为1 %（v/v） 的醋酸中，搅拌15 min使海藻酸钠完全溶解即得到0.2%（m/v）的海藻酸钠溶液；再将2 mL浓度为10 mmol/L 氯铂酸加入到47 mL 0.2%（m/v）的海藻酸钠溶液中，避光涡旋搅拌，然后逐滴加入1 mL浓度为0.2 mol/L新配制的硼氢化钠溶液，并于5min之内加完，暗处搅拌，得到海藻酸钠-铂纳米粒子，其中铂元素的质量浓度为78.03 mg/L。

3. 根据权利要求1或2所述的一种基于海藻酸钠-铂纳米粒子氧化酶活性的原花青素检测方法，其特征是在有溶解氧存在的溶剂中，无过氧化氢的参与下，海藻酸钠-铂纳米材料可以催化O₂所生成的O₂^•−，且所生成的O₂^•−可与抗坏血酸反应而被抗坏血酸清除，使得抗坏血酸在250 nm处的紫外特征吸收峰消失，是一种新型的氧化模拟酶。

4. 根据权利要求1或2所述的一种基于海藻酸钠-铂纳米粒子氧化酶活性的原花青素检测方法，其特征是在有氧气的条件下，阴极O₂还原峰在-0.34 V处出现；而在通氮情况下，去除氧气后，没有峰出现；这表明海藻酸钠-铂纳米粒子是一种新型的氧化模拟酶，能够催化氧气发生氧化还原反应。

5. 根据权利要求1或2所述的一种基于海藻酸钠-铂纳米粒子氧化酶活性的原花青素检测方法，其特征是对显色反应造成影响的几种因素，包括反应体系的pH值，反应体系的温度以及反应体系的底物浓度等，利用单因素的控制变量法，进行逐一优化，以确定氧化反应外在条件的影响；通过测定450 nm处的吸光度A₄₅₀，以确定利于颜色反应的最佳条件；对于所构建的海藻酸钠-铂纳米粒子-TMB显色体系，其最适反应条件为：50 mmol/L磷酸缓冲溶液的pH为4.5、反应体系的反应温度为37 °C、反应时间为5分钟、底物3, 3’, 5, 5’-四甲基联苯胺盐酸盐溶液的浓度为0.15 mmol/L。