[发明专利]豇豆血红素铁结合蛋白及其制备方法和应用

说明书

本发明提供了一种豇豆血红素铁结合蛋白及其制备方法和应用，涉及农残检测技术领域。本发明以耐热性强、适应各种条件、在不同环境中能良好的生长的豇豆种子为原材料提取豇豆粗酶液，并将提取液进一步分离纯化，具有产量大和来源广的优势。本发明利用比色法和荧光法研究了所述豇豆血红素铁结合蛋白对农药毒死蜱、克百威的敏感性；同时还利用Native‑PAGE对农药敌敌畏进行敏感性检测，发现所述豇豆血红素铁结合蛋白对上述农药都有较好的敏感性，因而有很大的优势可以作为替代酶源用于酶抑制法的农残快检中。

技术领域

本发明属于农残检测技术领域，具体涉及豇豆血红素铁结合蛋白及其制备方法和应用。

背景技术

酶抑制法在农残中的应用是在1951年提出的，其应用广泛也较早。酶抑制法的主要检测原理是有机磷类、氨基甲酸酯类农药对胆碱酯酶与羧酸酯酶等有很强的抑制力，能进一步影响酯酶酶促反应中酶与底物反应过程，从而影响底物与显色剂的反应，这种显色反应可以在生物体外反应出农药的抑制力，通过观察反应体系的颜色变化或者酶与某种特定化合物结合后的理化信号强弱判定样品中是否含有农药，以及农药残留量是否超标。一般情况下，在体外的实验检测中，农药的引入会使检测用酶的酶活受到一定的影响，当提高农药的加入量时，所用酶的酶活会减小，而酶对底物水解后生成的底物累积量是与酶活性正相关的，酶活力越大，产物则越多。主要方法有：检测生成产物的醋酸变化量的ΔPH法；检测生成产物醋酸的电位法；检测生成产物醋酸与NaHCO₃反应后进一步生成二氧化碳，然后检测二氧化碳产生的压力；检测水解产物与显色剂作用后的颜色的比色法等。近年来市场上使用的农残检测技术、农药残留检测设备大多都是基于酶抑制法的原理设计的。目前市场上也已经研制出了多种基于酶抑制法原理的农残快速检测试剂盒，且国外多个国家也将这类试剂盒作为在田间进行初步筛查农药残留量的主要手段。酶抑制法有着方法简单易于操作，成本低，检测用时短，可行性高，样品检测量大，有时对样品的要求不高，简单处理后即可检测等特点，适合基层的技法人员、家庭及个人使用的检测方法。作为目前市场使用最广泛的方法，国内也出台了多个标准指导其使用，如GB/T18625、GB/T18626、GB/T18630等。因此，在可期的未来，酶抑制法依然是农残快检技术中一个非常重要的检测方法。

酶抑制法在国内广泛推广的这些年中，所使用的酶源主要有动物来源的乙酰胆碱酯酶，酶源单一且提取成本昂贵，且易受酶浓度、底物种类与浓度、pH值等的影响。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种植物性来源的豇豆血红素铁结合蛋白，功效类似于乙酰胆碱酯酶，对多种农药敏感性高，可将其应用于在酶抑制法农残快检，且制备成本低廉、稳定性好、保存期长。

为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

本发明提供了豇豆血红素铁结合蛋白的制备方法，包括以下步骤：

(1)将豇豆粉碎后与PB缓冲溶液混合后，震荡提取，静置2h后，离心得上清液；

(2)将所述上清液过凝胶层析柱分离纯化，以PB缓冲液作为流动相，流速设置为0.75mL/min，1.5MPa作为最大柱压值，紫外检测器波长为280nm，收集每个吸收峰下洗脱液；

(3)筛选所述洗脱液中比酶活为3～5U/μg，酶活＞0.6U/mL，且与氯化血红素结合能力Kd值3.50μM的部分，得到所述豇豆血红素铁结合蛋白。

优选的，步骤(1)所述豇豆粉碎后过100目筛，收集筛下成分，得豇豆粉；所述豇豆粉与所述PB缓冲溶液的质量体积比为1g：(20～30)mL。

优选的，步骤(1)所述震荡提取的温度为38～42℃，震荡频率为10～20rpm，提取的时间为25～40min。

优选的，步骤(2)所述凝胶过滤层析柱包括Superdex-75凝胶过滤层析柱。