[发明专利]一种抗PD-1抗体的制备方法

说明书

本发明提供了一种抗PD‑1抗体的制备方法，该方法适用于抗PD‑1抗体的大规模生产。该方法所制备的抗PD‑1抗体不具有糖基化，不易产生免疫原性，避免患者使用后产生不良反应；同时该方法所提供的抗PD‑1抗体的纯化方法，解决了在抗体生产过程中容易产生聚体的技术问题。

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体地本发明涉及一种抗PD-1抗体的制备方法，更具体地，本发明公开了一种不含糖基化的抗PD-1抗体的制备方法。

背景技术

程序性细胞死亡蛋白1（PD-1： Programmed Cell Death Protein 1，也称为CD279）是表达于活化的T细胞和前B细胞（pro-B cells）上的一种细胞表面受体，是一种免疫检查点蛋白，对免疫系统有负调控作用，通过抑制T细胞炎性活动促进自身耐受，更具体而言，PD-1通过促进淋巴结中抗原特异性T细胞的凋亡和降低调节性T细胞的凋亡的双重机制防止自身免疫的发生，但也可以阻止免疫系统杀死癌细胞。

癌细胞的“免疫逃逸”被认为是肿瘤发生、发展和抗药的主要机制。肿瘤可通过直接或间接抑制T细胞的信号来保护自己躲过免疫系统的清除。肿瘤的免疫检查点疗法（immune chenkpoint therapy）是一类通过共抑制或共刺激信号等一系列途径调节T细胞活性来提高抗肿瘤免疫应答的治疗方法。

PD-1可与2种配体结合（B7家族成员PD-L1和PD-L2）。在小鼠上，PD-L1广泛表达于心、肺、胸腺、脾、肾等多种器官上，以及几乎所有的小鼠肿瘤细胞系，并在多种人类肿瘤细胞上高表达；而PD-L2的表达较为局限，主要是树突状细胞和少数肿瘤细胞系。因此，PD-1及其配体PD-L1成为抗肿瘤免疫治疗的靶点。

程序性细胞死亡蛋白-1（programmed death-1，PD-1）及其配体（PD-L1）抑制剂，是免疫检查点疗法的主要药物，其应答之广度、深度、和持久性均十分罕见，是近年来肿瘤免疫疗法研究的热点。目前已上市的纳武单抗Opdivo（nivolumab）和帕博利珠单抗Keytruda（pembrolizumab）属于PD-1抑制剂，主要用于黑素瘤、非小细胞肺癌、肾细胞癌、膀胱癌、霍奇金淋巴瘤、尿路上皮癌、微卫星高不稳定性癌等恶性肿瘤的治疗。

PD-1抑制剂（抗PD-1抗体）是一类阻断PD-1的药物，激活免疫系统攻击肿瘤，并用于治疗某些类型的癌症。

然而抗体药物在取得良好治疗效果的同时，也可能会引发不同程度的过敏反应和抗抗体反应，即人体对外源免疫球蛋白的免疫反应。抗体药物作为外源性蛋白，不可避免地会激活机体自身的免疫反应，诱导产生抗药物抗体，从而严重影响其安全性和有效性，生物药物的糖基化修饰对其结构和功能均有较大影响，进而影响药物的免疫原性。

糖基化是蛋白质的一种重要的翻译后修饰。蛋白质分子表面的糖链可对蛋白质分子的结构和功能产生深远的影响，糖基化作为重要的翻译后加工过程，对蛋白质的正确折叠、定位、免疫原性以及生物学活性有很大的影响。 单克隆抗体mAb 的糖基化聚糖结构与抗体效应功能之间密切相关，糖基化作用还会影响单克隆抗体mAb 的安全性特征，特别是非人源聚糖，具有潜在的免疫原性。

糖基化修饰高度依赖于细胞表达系统和亚克隆选择，细胞培养过程中的诸多因素，如培养基的成分，培养条件均会影响糖基化，进而影响治疗性蛋白的生物学活性，疗效，免疫原性以及药代动力学。

糖基化参与了蛋白折叠、跨膜转运、细胞粘附、免疫应答等一系列蛋白功能。单克隆抗体药物的糖基化与药物疗效、药物代谢、药物稳定性与免疫原性等成药性关系密切。糖基化修饰可以促进单克隆抗体的稳定性和可溶性，对抗体制备过程中的聚体产生也会存在影响，含有糖基化的蛋白质在生产过程中产生的聚体会减少。

在单克隆抗体的大规模生产过程中，需要获得安全性、有效性俱佳的产品，对于某些蛋白质生产，就需要减少其糖基化的产生；但是减少糖基化后，又存在影响蛋白质的溶解性、容易产生聚体的问题。

发明内容