[发明专利]一种活动精子DNA碎片流式细胞术检测方法

说明书

本发明公开了一种活动精子DNA碎片流式细胞术检测方法，特点是包括以下步骤：(1)将5～10万个精子加入500μL含有钼酸铵、曲拉通的盐酸缓冲液，混匀30秒后加入罗丹明6G和吖啶橙染色液；(2)流式细胞仪上机检测，收集绿、黄、红等三色发射荧光信号；(3)结合三种荧光情况分析，即首先在黄色荧光的基础上将活动精子与不动精子区分出来，再进一步分析活动精子中红色荧光精子占活动精子总数的比例，从而可以判定样本中活动精子DNA碎片化情况，优点是实现了一次性流式细胞术检测活动精子DNA碎片情况，且简单、高效。

技术领域

本发明涉及体外诊断试剂领域，尤其是涉及一种活动精子DNA碎片流式细胞术检测方法。

背景技术

受精过程中，精子贡献了一半的遗传物质DNA。精子DNA完整性可影响精子受精能力、受精后原核的形成、胚胎着床、胚胎发育及子代的健康，精子DNA碎片化指数(DNAfragmentation index，DFI)已经成为评估男性生育力的重要指标。传统方法是检测了所有精子的DFI，即包括死精子、不活动精子和活动精子的DFI混合情况。无论是自然受孕，还是辅助生殖技术(assisted reproductive technology，ART)治疗过程中，只有活动的精子才被分选出来和应用于受精，故理论上活动精子DFI才是隐藏的、被忽视的重点。

精子的活动与精子尾部有关，精子运动靠着精子尾部鞭毛摆动产生动力。目前认为精子运动是按照滑动模式进行的。其基本原理是：动力蛋白水解ATP(三磷酸腺苷)驱动临近微管间的相对滑动。精子尾部鞭毛中动力蛋白ATPase(三磷酸腺苷酶)以ATP作为底物，通过水解ATP成为ADP(二磷酸腺苷)和pi(磷酸)而获得能量，促使鞭毛轴丝中的双联微管中A微管的两行支臂，不断脱离并重新依附于相邻双微管中B微管上连续结合的位点，从而产生双联微管间的滑动并产生一个纵向力；与双联微管有关的各种附属结构形成的滑动抗力，使由支臂产生的纵向力转化为横向弯曲动力，引起浪状波的形成和传播。换句话说，通过检测精子尾部ATP降解成为ADP和pi的情况，可从根源上检测和反应活动精子情况。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种简便、高效地检测和区分活动精子和非活动精子的DNA碎片情况的活动精子DNA碎片流式细胞术检测方法。

本发明解决上述技术问题所采用的技术方案为：一种活动精子DNA碎片流式细胞术检测方法，包括以下步骤：

(1)将精液中5～10万个精子加入到500μL酸化处理缓冲液中，混匀，置冰上30秒；

(2)在步骤(1)得到的混合液中加入10μL染色液，5-30分钟内上机检测，设定流式细胞仪的参数，包括激发波长和激发波长通道，收集精子的绿(530nm)色、黄(556nm)色和红(640nm)色荧光信号，每管样本至少记录样本主群5000个细胞；

(3)流式软件统计分析：结合三种荧光情况，即首先在黄色荧光的基础上将活动精子与不动精子区分出来，再进一步分析活动精子中红色荧光精子占活动精子总数的比例，从而可以判定样本中活动精子DNA碎片化情况。

步骤(1)所述的酸化处理缓冲液的配方为80-800mmol/L盐酸(HCl)、14-28mmol/L钼酸铵、0.15mol/L氯化钠(NaCl)、0.1％Triton-X 100(曲拉通)，溶剂为水。主要成分为曲拉通、盐酸、钼酸铵，目的是：A、促使细胞膜通透性增加，使染料容易进入精子细胞；B、提供酸环境便于磷钼杂多酸与罗丹明6G形成缔合物；C、使紧密的DNA变得结构较为松散，以便于吖啶橙染色；D、酸可以固定细胞，阻抑了荧光染料与细胞其他成分如蛋白质、多糖和细胞膜等结合，降低背景信号。