[发明专利]一种基于拉曼光谱的微生物单细胞生长检测方法

权利要求书

1.一种基于拉曼光谱的微生物单细胞生长检测方法，其特征在于，包括如下步骤：

步骤一、在实验室中，将微生物在最适其培养的条件下进行培养，并培养至不同生长时期；

步骤二、采用光密度法，测量培养时间为1h、2h、3h、4h、6h、14h的微生物细胞密度，即OD₆₀₀；

步骤三、采集不同生长时期的微生物单细胞拉曼光谱；应用拉曼光谱仪，选择光谱仪参数，采集所有单细胞拉曼光谱数据；所述采集不同生长时期为：分别采集培养时间为1h、2h、3h、4h、6h、14h的微生物单细胞拉曼光谱，每个时间段采集50组拉曼数据，六个时间段共计300组；

步骤四、对微生物单细胞拉曼光谱进行标准化处理，包括如下具体操作：

步骤4.1，对微生物单细胞拉曼光谱去除宇宙射线；

基于差分法，首先计算微生物单细胞拉曼光谱各波数峰强差分，设置宇宙射线判别阈值，若某点差分大于该阈值，可确定该波数峰为宇宙射线并选取前后点坐标值抹平该宇宙射线，公式可表示为：

式中，为某波数的差分值，(y_max-y_min)/Δ为宇宙射线判别阈值，Δ为设置窗口宽度，Y_i为某波数峰强值，Y_i-1、Y_i+1为其波数前、后波数峰强值；

步骤4.2，应用自适应迭代重加权惩罚最小二乘算法或滑动小波变换对微生物单细胞拉曼光谱进行基线校正；

步骤4.3，对微生物单细胞拉曼光谱进行自适应平滑滤波，设置信噪比阈值，若拉曼光谱信噪比小于所述信噪比阈值，应用Savitzky-Golay卷积平滑算法进行一次平滑处理，再次计算平滑后信噪比，直到信噪比大于所述信噪比阈值；

信噪比计算方法公式：

其中，Y_max和Y_min为全谱段最大最小强度值，y_max和y_min为静默区最大最小强度值；

步骤4.4，将微生物单细胞拉曼光谱进行无量纲化处理；

步骤五、确定不同培养时间的微生物单细胞所属生长时期；

用层次聚类算法将微生物单细胞拉曼光谱聚成4个簇，分别对应生长周期的4个时期，统计每个簇中包含各培养时间的单细胞分布情况，将各培养时间段映射到4个生长时期，分析4个生长时期单细胞培养时间的数据分布，设定比例阈值，若各簇中都存在占该簇总数量大于比例阈值的培养时间段，则将该培养时间映射到簇所表示的生长时期；如果最大占比小于所述比例阈值，根据OD₆₀₀值，重新训练聚类算法，调整簇划分；

步骤六、求各生长时期微生物单细胞拉曼光谱均谱，确定所求物质峰位、峰宽，并求峰面积；具体操作包括：

步骤6.1，根据步骤五，将簇中占比最大的培养时间所有单细胞的拉曼光谱求均谱；

步骤6.2，确定标准峰位；

步骤6.3，峰面积计算过程具体包括：

6.3.1,用于修正实验中拉曼光谱峰位偏移，利用小波变换求一维阵列的峰位，通过对每个宽度的小波进行卷积来平滑向量，在足够长的尺度上出现的具有足够高信噪比的相对最大值被接受，标记波数范围和强度，为了消除光谱边缘效应，去除寻峰结果中首尾谱峰；

6.3.2,基于滑动平滑窗口对峰位进行二次校正，修正不同仪器所测拉曼光谱精确峰位；

6.3.3,特征物质含量计算，

X_i→T_i

其中，X_i表示波数值，T_i表示波数对应序列，S表示选定峰面积，表示胞内物质含量，t₁和t₂表示峰波数的起止位置；

步骤七、不同生长阶段单细胞胞内物质变化可视化分析；所述可视化分析包括：蛋白、核酸峰面积随生长时间变化的柱状图，蛋白与核酸比率变化柱状图。

2.根据权利要求1所述的一种基于拉曼光谱的微生物单细胞生长检测方法，其特征在于，所述微生物包括：细菌、真菌、藻类。

3.根据权利要求1所述的一种基于拉曼光谱的微生物单细胞生长检测方法，其特征在于，所述设置窗口宽度设置为：2-5个波数。

4.根据权利要求1所述的一种基于拉曼光谱的微生物单细胞生长检测方法，其特征在于，所述snr为：10-20。