[发明专利]一种基于拉曼光谱的微生物单细胞生长检测方法

说明书

本发明一种基于拉曼光谱的微生物单细胞生长检测方法，设计构思是基于机器学习中聚类分析算法，结合培养时间(或ODsubgt;600/subgt;)确定单细胞的生长时期，通过分析单细胞拉曼光谱，检测微生物单细胞生长过程中胞内物质生长变化，该方法能快速、灵敏且无需标记的检测微生物单细胞生长，解决了现有技术存在耗时、操作繁琐、劳动力昂贵和试剂敏感等问题，操作简单，适合推广。

技术领域

本发明涉及一种单细胞生长检测方法，尤其是一种基于拉曼光谱的微生物单细胞生长检测方法。

背景技术

微生物生长分为不同的阶段：滞后期(为细胞分裂做准备)，对数期(以细胞加倍为特征)、稳定期(细胞生长速率和凋亡速率相等)和死亡期(细胞死亡)四个生长周期；

在一个封闭的环境中，由于细胞的生长，所需的营养液被消耗殆尽，细胞的群体呈现了生长曲线的各个时期，不同的生长阶段具有不同的生化反应，以合成细胞生长和分裂所必须的细胞成分；准确识别微生物的生长时期，对于实时监测食品发酵、生物制药等工程菌的代谢状态，判断反应终点具有重要意义；

现有技术中，对微生物生长时期的检测方法主要基于群体细胞水平，这种群体细胞检测方法(如光密度、标准平板计数等)存在耗时、操作繁琐、需要样品量大、不适用于连续监测等问题；而且，现有方法也不能描述单个微生物细胞在生长过程中胞内物质(如DNA、蛋白质、脂质等)相对含量所发生的变化；

如何快速、灵敏的从本质上检测微生物单细胞在生长过程中所发生的生化变化，是单细胞生长研究的重要难题。

发明内容

本发明的目的是，提供一种基于拉曼光谱的微生物单细胞生长检测方法，该方法能快速、灵敏且无需标记的检测微生物单细胞生长，解决了现有技术存在耗时、操作繁琐、劳动力昂贵和试剂敏感等问题，操作简单，适合推广。

一种基于拉曼光谱的微生物单细胞生长检测方法，包括如下步骤：

步骤一、在实验室中，将微生物培养在最适其培养的条件下，并培养至不同生长时期；

作为一种举例说明，所述微生物包括但不限于：细菌、真菌、藻类；

步骤二、利用现有生长曲线检测方法检测微生物生长时期；测量培养时间为1h、2h、3h、4h、6h、14h的微生物细胞密度，即OD₆₀₀；

作为一种举例说明，所述现有生长曲线检测方法：包括但不限于光密度、比浊法、标准平板计数法等；

步骤三、采集不同生长时期的微生物单细胞拉曼光谱；应用拉曼光谱仪，选择调整光谱仪参数，探索最佳参数设置，采集所有单细胞拉曼光谱数据；

作为一种举例说明，分别采集培养时间为1h、2h、3h、4h、6h、14h的微生物单细胞拉曼光谱，每个时间段采集50组拉曼数据，六个时间段共计300组；

步骤四、对微生物单细胞拉曼光谱进行标准化处理，包括如下具体操作：

步骤4.1，对微生物单细胞拉曼光谱去除宇宙射线；

基于差分法，首先计算微生物单细胞拉曼光谱各波数峰强差分，设置宇宙射线判别阈值，若某点差分大于该阈值，可确定该波数峰为宇宙射线并选取前后点坐标值抹平该宇宙射线，公式可表示为：

式中，为某波数的差分值，(y_max-y_min)/Δ为宇宙射线判别阈值，Δ为设置窗口宽度，Y_i为某波数峰强值，Y_i-1、Y_i+1为其波数前、后波数峰强值；

作为一种举例说明，所述设置窗口宽度可设置为2-5个波数；