[发明专利]利用CRISPR/Cas12a系统靶向富集核酸目标区域的方法及其应用

权利要求书

1.一种富集核酸目标区域的方法，其特征在于，包括：

（1）针对所述核酸的目标区域，设计一组RNA序列，所述一组RNA序列包括第一RNA和第二RNA，

所述第一RNA包括依次相连的第一启动子序列、Cas12a蛋白scaffold序列、第一sgRNA分子、第一插入序列和第一互补序列，所述第一sgRNA分子和所述第一互补序列均与所述目标区域的上游序列互补，所述第一sgRNA分子和所述核酸的一条链互补，所述第一互补序列和所述核酸的另一条链互补，

所述第二RNA包括依次相连的第二启动子序列、Cas12a蛋白scaffold序列、第二sgRNA分子、第二插入序列和第二互补序列，所述第二sgRNA分子和所述第二互补序列均与所述目标区域的下游序列互补，所述第二sgRNA分子和所述核酸的一条链互补，所述第二互补序列和所述核酸的另一条链互补；

步骤（1）中所述第一互补序列和所述目标区域的上游序列互补位置作为第一位置，所述第二互补序列和所述目标区域的下游序列互补位置作为第二位置，所述第一位置和所述第二位置的距离为100~300bp；

（2）将所述一组RNA序列和Cas12a蛋白混合，进行第一孵育处理，以便获得复合物；

（3）将所述复合物、所述核酸、逆转录酶、变性剂和dNTP混合，进行第二孵育处理，并进行变性处理，以便获得变性产物；

（4）去除所述变性产物中的RNA和蛋白质，进行PCR扩增，以便获得富集产物。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（2）中所述第一孵育处理为在20~28摄氏度温度下孵育10~30分钟。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（2）中所述第一孵育处理为在25摄氏度温度下孵育15分钟。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（3）中所述第二孵育处理为在35~40摄氏度条件下进行第二孵育。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（3）中所述第二孵育处理为在37摄氏度条件下孵育1~2小时。

6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述第一启动子序列和所述第二启动子序列各自独立地选自T7启动子序列、U6启动子序列中的至少一种。

7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述第一启动子序列和所述第二启动子序列均为T7启动子序列。

8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（1）所述第一位置和所述第二位置的距离为180~250bp。

9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（4）中利用RNA酶去除所述RNA，利用蛋白酶K去除所述蛋白质。

10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，利用RNA酶在37摄氏度温度下孵育10~20分钟，以便去除所述RNA。

11.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，利用蛋白酶K在37摄氏度温度下孵育8~10小时，以便去除所述蛋白质。

12.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述变性剂为DTT。

13.根据权利要求12所述的方法，其特征在于，所述变性剂的使用浓度为0.5~5mM。

14.根据权利要求12所述的方法，其特征在于，所述变性剂的使用浓度为1mM。

15.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在80~90摄氏度温度下处理10~20分钟，以便进行所述变性处理。