[发明专利]利用CRISPR/Cas12a系统靶向富集核酸目标区域的方法及其应用

说明书

本发明涉及一种利用CRISPR/Cas12a系统靶向富集核酸目标区域的方法及其应用。该方法包括(1)设计第一和第二RNA，第一RNA除第一sgRNA分子，还含有第一互补序列，第二RNA除第二sgRNA分子，还含有第二互补序列，第一sgRNA分子和第一互补序列与目标区域上游互补，第二sgRNA分子和第二互补序列与目标区域下游互补；(2)与Cas12a蛋白混合获得复合物；(3)将复合物、核酸、逆转录酶、变性剂和dNTP混合孵育和变性，获得变性产物；(4)去除RNA和蛋白质，扩增获得富集产物。由此可简便、快捷实现目标区域的富集，应用于测序领域。

技术领域

本发明涉及分子生物学技术领域，特别涉及核酸捕获测序领域，具体涉及一种利用CRISPR/Cas12a系统靶向富集核酸目标区域的方法及其应用。

背景技术

近年DNA测序技术得到了不断地发展，由传统的Sanger测序技术发展到当前“下一代测序技术(NGS)”，NGS突出的特点就是可以实现数百万甚至亿万个测序反应同时进行，提高了测序通量，实现了测序高通量，使得DNA的信息不断被解析，DNA测序对于性状的遗传调控、疾病形成等方面的理解具有积极意义。

尽管NGS技术的不断发展，但目前对于全基因组测序仍存在成本较高的弊端，并且我们经常不需要对全基因组进行测序，而只需要对特定感兴趣的区域进行DNA测序，还可以有效降低测序成本以及人力物力，因此靶向富集目标区域DNA的方法应运而生。目前常见的靶向富集方法是利用液相杂交进行捕获目标区域，从而能够对感兴趣的基因组区域进行靶向捕获富集，缩小了测序范围，实现目标区域的有效捕获富集。

利用液相杂交捕获可以有效靶向富集目标区域，但通常需要较长时间的杂交时间(16-24h)，且需要较多输入量的DNA，同时高温变性也容易导致非特异性杂交，导致背景噪音加大，使得靶向效率不佳，同时杂交后需要繁琐的洗脱程序，费时费力。

因此很有必要提供一种快捷、高效、精准的目标区域富集的方法很有必要。

发明内容

本发明旨在至少在一定程度上解决现有技术中存在的技术问题之一。为此，本发明提供了一种利用CRISPR/Cas12a系统靶向富集核酸目标区域的方法及其应用。

CRISPR技术是一种源于古细菌免疫系统的技术，可以有效的识别目标区域PAM序列，从而对目标序列进行编辑。近日，David Liu等(参考文献Anzalone A V,Randolph P B,Davis J R,et al.Search-and-replace genome editing without double-strandbreaks or donor DNA[J].Nature,2019.)团队改进了现有的基因编辑CRSPR/cas9技术，提出了先导编辑(Prime editing)的概念，该技术可以实现目标序列的精确插入，并能有效降低脱靶效应，这一技术的提出将使得我们捕获目的序列变的简单高效。Cas12a(Cpf1)是一种类似于Cas9的蛋白，其识别基因组的PAM序列为TTTN，切割位点远离识别序列，形成粘性末端，这为目标区域的精确编辑提供了有效的保障(参考文献Zetsche B,Gootenberg J S,Abudayyeh O O,et al.Cpf1 Is a Single RNA-Guided Endonuclease of a Class2CRISPR-Cas System[J].CELL,2015,163(3):759-771.)。本发明的发明人通过研究，创造性地发现，可以利用CRISPR/Cas12a系统以及先导编辑对核酸的目标区域进行有效编辑，从而对其进行高效精准捕获，然后借助于通过PCR扩增有效富集目的区域，最后对目标区域进行高通量测序并进行分析，有效降低了测序成本，提高了捕获的特异性以及灵敏性，将在DNA检测等领域具有很强的实用性。