[发明专利]用于检测花生黑腐病菌的LAMP检测引物及其检测方法

说明书

本发明公开用于检测花生黑腐病菌（Calonectria ilicicola）的LAMP检测引物及其检测方法，可用于花生黑腐病菌的特异性检测。通过设计花生黑腐病菌的LAMP检测引物，包括一对外引物和一对内引物，序列如SEQ ID NO.1‑4所示。经恒温扩增，采用SYBR green І显色剂显色或琼脂糖凝胶电泳检测，可观察到绿色荧光或出现LAMP特征性的梯形条带。所述的LAMP引物及检测方法可用于生产实践中花生黑腐病菌感染的植株或者发病潜伏期时花生黑腐病菌的快速、灵敏、准确的检测及花生种子的检验检疫，同时可用于田间病害的早期诊断和病菌的监测、鉴定，为防治花生黑腐病菌提供可靠的技术和理论依据。

技术领域

本发明属于农作物病害检测、鉴定及防治技术领域，具体涉及用于检测花生黑腐病菌（Calonectria ilicicola）的LAMP检测引物及其检测方法，可用于花生黑腐病菌高灵敏度、快速的特异性分子检测，还可用于花生黑腐病的早期诊断、病原菌的鉴定和监测及花生种子的检验检疫。

背景技术

花生黑腐病（Calonectria ilicicola）1965年首次在美国乔治亚州发现，之后迅速扩散至全美国的花生产地。目前主要分布于美国、日本、印度以及澳大利亚的花生产区。花生黑腐病由寄生柱枝孢菌(Cylindrocladium parasiticum Crous,Wingfield＆Alfenas）引起，有性阶段为冬青丽赤壳菌（Calonectria ilicicola Boedign Reitsma）。该病原菌可侵染花生的果针、荚果和根系，罹病部位变黑腐烂，并导致植株萎蔫和死亡。花生黑腐病造成的产量损失一般在10％左右，严重的超过50％，是一种毁灭性的病害。花生黑腐病菌还可以侵染大豆、苜蓿等 20多种重要作物和其他植物。花生黑腐病的防治非常困难，没有高抗的花生品种和有效的化学药剂可用，农业防治难以奏效，土壤熏蒸有一定的效果，但费用昂贵且污染环境。2009年花生黑腐病在我国广东省首次发现，该病菌已经被我国列为进境植物检疫性病原菌。因此，开展花生黑腐病菌快速检测方法的研究，对防止病原菌的蔓延传播以及该病害的早期诊断和防治具有十分重要的意义。

目前，花生黑腐病菌的检测方法包括传统分离培养法和分子生物学等方法。黑腐病菌的传统检测方法是采用PDA培养基对病原物进行分离纯化，然后进行一系列的生理生化实验进行诊断。该方法不仅速度慢时间长，还容易受外界因素的影响且灵敏度较低，难以满足花生黑腐病诊断的实际需要。PCR技术为植物病原菌的检测提供了新途径，但是PCR特异性检测技术需要PCR仪、电泳和凝胶成像系统等专业仪器和分子生物学试剂，且需要分子生物学专业实验人员操作，限制了PCR检测方法的推广应用。因此，建立一套快速、灵敏、准确的花生黑腐病菌检测诊断技术不仅非常必要，而且十分迫切。

环介导等温扩增技术（loop-mediated isothermal amplification，简称LAMP）是2000年由日本荣研株式会社Notomi等人开发的一种新型循环恒温核酸扩增技术。LAMP反应针对靶基因的6个位点设计出4条引物，利用一种链式置换活性的DNA聚合酶（Bst DNApolymerase），在恒温条件下（60–65℃）保温30–90分钟，即可完成扩增反应。由于LAMP反应的高效性和等温快速扩增的特点，在90分钟内可扩增10⁹–10¹⁰倍，其扩增产物的检测一般采用荧光染料目测观察、琼脂糖凝胶电泳和浊度观察等方法。由于LAMP反应简单、快速、高效、经济等特征，因而具有极为广泛的应用前景。目前LAMP检测主要应用于人畜病原物、食品安全和环境卫生的检测，在植物病原菌检测中报道较少，将LAMP方法应用于花生黑腐病菌的检测国内外均未见报道。

发明内容