[发明专利]一种免提取新型冠状病毒核酸检测的方法与试剂盒

权利要求书

1.一种免提取新型冠状病毒核酸检测的方法与试剂盒，包括nCoV反应液、PCR增强剂、nCoV阳性质控、nCoV阴性质控。

2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，nCoV反应液含有引物探针、DNA聚合酶、逆转录酶、三磷酸核苷、MgCl2、Tris-HCl，KCl，TritonX-100和纯化水。

1)引物和荧光探针包括第一对和第二对引物和探针，所述第一对和第二对引物和荧光探针为分别针对新型冠状病毒两个不同基因ORF1ab和N基因的保守序列设计的第一对和第二对特异性正反向引物和荧光探针。

ORF1ab基因特异性的正向和反向引物的序列分别是5’-GGCTTCACATATGTATTGTTC-3’，和5’-GCTCAAACTCTTCTTCTTCAC-3’；ORF1ab基因特异性的探针的序列是5’-TCACCTTCTTCTTCATCCTCATCTGG-3’，并且，探针的两端分别标记有荧光发生基团FAM和荧光淬灭基团BHQ1；

N基因特异性的正向和反向引物的序列分别是5’-AAGGCTTCTACGCAGAAG-3’，和5’-GTGCCTGGAGTTGAATTTC-3’；N基因特异性的探针的序列是5’-AGCCTCTTCTCGTTCCTCATCAC-3’，并且，探针的两端分别标记有荧光发生基团ROX和荧光淬灭基团BHQ2；

2)nCoV反应液含pH值为8.0～8.8的5-10mmol/L Tris-HCl、5-10mmol/L MgCl₂、30-50mmol/L KCl；

3)nCoV反应液中酶系由热启动DNA聚合酶、逆转录酶、UNG酶、dNTPs组成，特征在于每人份反应酶系中DNA聚合酶的用量为2U；逆转录酶用量为1.5U；UNG酶用量为0.2U；dNTPs为20mmol/L。

3.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于其包含PCR增强剂：甲酰胺、甘油、BSA。

4.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于PCR扩增的条件为：50℃5-20分钟，96℃30-90秒；96℃1-3秒，58℃6-15秒，45个循环。

5.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于所述阳性质控品为含有插入新型冠状病毒冠状病毒特异型保守序列的pUC57载体质粒，阴性质控品为含人管家基因β-Globin基因序列的TE缓冲液。