[发明专利]一种免提取新型冠状病毒核酸检测的方法与试剂盒

说明书

本发明提供一种免提取荧光聚合酶链反应(荧光PCR)定性检测新型冠状病毒的方法和试剂盒，属于生物技术与医学领域。本发明的方法将样本核酸释放与扩增融为一体，试剂盒中包含了裂解液和快速酶，可以直接对病人呼吸道分泌物进行裂解与扩增，使整个检测过程快速，简便，减少相互污染的机会，获得的PCR检测结果准确可靠，能够尽快确诊病人分泌物中是否存在新型冠状病毒，在疾病监测、临床诊断等领域具有重要的应用价值。

技术领域：

本发明涉及生物技术与医学领域，具体涉及了一种用于检测新型冠状病毒的方法和试剂盒。适用于新型冠状病毒感染的检测和临床辅助诊断。

背景技术：

新型冠状病毒肺炎是由新型冠状病毒(Severe acute respiratory syndromecoronavirus 2,SARS-CoV-2)引起的疾病。2019年12月，武汉市部分医疗机构陆续出现不明原因肺炎病人，武汉市持续开展流感及相关疾病监测，2020年1月7日，实验室检出一种新型冠状病毒，获得该病毒的全基因组序列。目前传染源主要是新型冠状病毒感染的患者，隐性感染者也可能成为传染源，主要经呼吸道飞沫传播和接触传播，人群普遍易感。新型冠状病毒属于β冠状病毒属。进化分析显示，新型冠状病毒与来自中华菊头蝠(中国马蹄蝠的一种)的蝙蝠SARS样冠状病毒(bat severe acute respiratory syndrome-relatedcoronaviruses)最为相似，核苷酸同源性达到84％，与人类SARS病毒的核苷酸同源性达到78％，与MERS病毒的同源性达到约50％。目前尚无明确有效的抗新型冠状病毒的药物和疫苗，因此控制疫情的进一步发展主要靠及时的发现和隔离。

实时荧光PCR技术，通过引入特异性探针和荧光信号的动态监测使PCR产物的扩增及分析的全过程可以在单管内封闭完成，并且可以自动分析结果，具有实时、准确、快速、简便等特点，是一种先进的分子检测技术。目前已经在临床上应用的荧光PCR检测试剂和方法多达上千种；常规的通过荧光PCR检测病原体核酸的方法一般都需要两个独立的过程，一是病原体DNA或RNA核酸模板制备，二是将核酸模板加入到反应体系中进行PCR扩增检测。各种病原体结构的不同，在各个实验室使用和建立的核酸处理的试剂和方法也不完全一致。但处理过程基本一致，都需要经过消化裂解、吸附纯化、洗涤收集等多个步骤。对于单个样本的处理往往耗时数十分钟，需要对大量样本进行处理时，耗时甚至比PCR检测反应更长。由于繁多的操作步骤，在大样本处理过程中，样本之间的相互污染也不可避免；因防护不当，出现在处理过程中人感染病原体的情况也较为多见。

免提取荧光PCR技术采用优化的PCR缓冲液体系和特殊的DNA聚合酶，减少样本中存在的多种抑制剂对PCR反应的干扰，具有强活力、高稳定性、强耐受性等特点。该技术无需进行昂贵又费时的核酸抽提过程，使用动物标本或病原体保存液即可直接用于荧光PCR扩增鉴定，极大地简化了操作步骤和缩短了检测时间。免提取荧光PCR技术正在逐渐被应用于各项动植物基因的研究中，未来将广泛应用于临床病原体检测，积极地推动分子诊断的发展。

发明内容

本发明的目的在于提供一种免提取新型冠状病毒核酸检测的方法和试剂盒，简化操作步骤，缩短PCR检测时间。

为实现上述目的，本发明的技术方案是针对于新型冠状病毒两个不同的基因编码区的特异保守区域为靶标区域，设计两对特异性引物及荧光探针，同时设置了内标质控系统，用于整个反应体系的质量控制。

一种免提取新型冠状病毒核酸检测的方法与试剂盒，其包含nCoV反应液、PCR增强剂、nCoV阳性质控品和nCoV阴性质控品。

所述的新型冠状病毒检测试剂盒中的nCoV反应液包括引物探针、DNA聚合酶、逆转录酶、UNG酶、三磷酸核苷、镁离子、Tris-HCl、KCl，MgCl₂和TritonX-100。