[发明专利]小麦全蚀病菌禾顶囊壳LAMP检测引物组及方法

说明书

本发明涉及小麦全蚀病菌禾顶囊壳LAMP检测引物组及方法，属于基因工程技术领域，本发明以该病原菌的ITS为靶序列，建立禾顶囊壳的LAMP检测技术，采用的引物特异性强，反应体系的灵敏度高；通过对发病组织的检测，所述反应体系能够准确快速地从发病小麦组织中检测出小麦全蚀病。该检测方法简单、快速和灵敏，并且不需要昂贵仪器，有利于在基层植保站大面积推广和使用，为小麦全蚀病的早期、精准防控提供技术支持。

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，具体地，涉及小麦全蚀病菌禾顶囊壳LAMP检测引物组及方法。

背景技术

河南省是全国重要的粮食生产基地，是我国最重要的小麦主产区。近年来，随着免耕播种、小麦浅耕播种和秸秆还田等保护性耕作技术的实施以及机械化跨区作业，使得小麦土传病害的发生面积不断扩大。特别是小麦全蚀病，自1992 年在河南省发现以来，不断传播蔓延，近几年来更是在全省呈现大爆发的趋势，严重影响河南省小麦的安全生产。小麦全蚀病是由禾顶囊壳(Gaeumannomyces graminis)引起，危害小麦的根部和茎基部，严重时全田植株枯死，是小麦生产上的一种毁灭性土传病害。此外还有小麦纹枯病和小麦根腐病也是小麦重要的土传病害，但是这3种小麦土传病害的早期症状容易混淆，为在病害发生早期能够准确诊断病害，从而对症下药在病害发生的初期及时进行防治，达到事半功倍的效果，需要开发特异、敏度、快速的小麦全蚀病早期诊断技术。

环介导等温扩增 (Loop mediated isothermal amplification，LAMP) 技术是一种恒温体外核酸扩增技术。通过针对靶序列的６个区域设计一组４个特异引物，利用具有链置换活性的Bst DNA聚合酶，在60～65℃恒温条件下60 min即可扩增出10⁹个靶序列。相比常规PCR检测技术，该技术具有特异性强、灵敏度高、快速简便且成本低廉的特点，已广泛应用于病原微生物的检测。

发明内容

为了解决现有技术中的问题，本发明的目的在于提供小麦全蚀病菌禾顶囊壳LAMP检测引物组及方法，所述引物的特异性强，灵敏度高，能准确快速检测小麦全蚀病，为小麦全蚀病的早期、精准防控提供技术支持。

为了实现上述目的，本发明采用的具体方案为：

小麦全蚀病菌禾顶囊壳LAMP检测引物组，其特征在于：包括四条特异性引物，具体如下：

QS-FIP：CAGGGTTTGTAACCTCCGGCACATACCTTTACTGTTGCTTC；

QS-BIP：AACTTTCAACAACGGATCTCTTGGTTACTTATCGCATTTCGCTG；

QS-F3：AAACTCCAACCCCTGTGA；

QS-B3：ACTGAATTCTGCAATTCACA；

所述四个特异引物的靶标基因为小麦全蚀病菌禾顶囊壳的ITS。

本发明还提供利用所述LAMP检测引物组对小麦全蚀病进行检测的方法，包括以下步骤：

步骤一、提取基因组DNA：选取小麦植株的发病部位，提取基因组DNA，测定提取的基因组DNA的浓度和纯度，作为模板DNA，备用；

步骤二、确定反应体系：每25μL反应体系中，由以下成分组成：2.5 μL 10×ThermoPol Buffer，1.5 μL 100 mM MgSO₄、3.5 μL 10 mM dNTPs、10 μM QS-FIP和QS-BIP各4 μL、10 μM QS-F3和QS-B3各0.5 μL、１μL 8000U/mL Bst DNA Polymerase和１μL模板DNA，灭菌超纯水补足25 μL；