[发明专利]单核、二核及成熟玉米花粉分离方法及花粉发育阶段判定模型的构建与应用

权利要求书

1.一种玉米花粉的分离纯化方法，其特征在于，包括如下步骤：

在玉米花粉对应的发育时期取雄穗中部的小穗，加入研磨缓冲液，在0～4℃下研磨得研磨液；

以150～300目筛网过滤步骤（1）所得研磨液，收集滤液，再进行离心分离，弃上清液得富集沉淀物；

以研磨缓冲液重悬步骤（2）所得富集沉淀物，再以Percoll密度梯度分离液对其进行离心，得沉淀物；

向步骤（3）所得沉淀物加入纯化缓冲液洗涤后，离心分离得花粉细胞。

2.根据权利要求1所述的玉米花粉的分离纯化方法，其特征在于，在所述步骤（1）中，以每100mL计，所述研磨缓冲液的试剂原料组成如下：

8～12ml甘露醇、7.0～8.0mg KCl、5.4～5.8mg CaCl₂，余量为水。

3.根据权利要求1或2所述的玉米花粉的分离纯化方法，其特征在于，在所述步骤（4）中，以每100ml计，所述纯化缓冲液由以下试剂原料组成：

0.210～0.215g MES、5.80～5.90 mg NaCl、7.0～8.0g 蔗糖，以KOH调pH值至 6.0，余量为水。

4.根据权利要求1所述的玉米花粉的分离纯化方法，其特征在于，在所述步骤（3）中，所述Percoll密度梯度分离液由Percoll、研磨缓冲液按3:15～18的体积比组成。

5.根据权利要求1所述的玉米花粉的分离纯化方法，其特征在于，在所述步骤（2）中，离心条件为：0～4℃，转速2500～3500转/分，离心3～5分钟；在所述步骤（3）中，离心条件为：0～4℃，转速6000～7000转/分，离心5～10分钟；在所述步骤（4）中，离心条件为：0～4℃条件，转速3000～4000转/分，离心2～4分钟。

6.根据权利要求1所述的玉米花粉的分离纯化方法，其特征在于，在所述步骤（1）中，研磨破碎采用榨汁机，每研磨破碎3～5s后停顿5～10s，重复3～5次。

7.根据权利要求1所述的玉米花粉的分离纯化方法，其特征在于，在所述步骤（2）中，对于处于单核花粉时期，采用300目筛网过滤，处于二核花粉时期采用230目筛网过滤，处于成熟花粉时期则采用150目筛网过滤，以提高分离纯度。

8.一种构建玉米花粉发育阶段判定模型的方法，其特征在于，包括如下步骤：

(1) 取处于不同花粉发育时期的玉米雄穗中部的小穗，采用权利要求1所述的纯化分离方法，分离富集对应发育时期的花粉细胞，进行DAPI染色后确定花粉发育阶段及花粉直径；

(2)同时分别考察或测量玉米单核花粉期、二核花粉期、成熟花粉期所对应的玉米植株的叶环数、雄穗上小穗长度；

(3)将玉米植株叶环数、雄穗上小穗长度、花粉直径与对应的花粉时期进行逻辑回归，建立如下预测模型：

其中，y为叶环数，s为小穗长度，mm；h为花粉直径，μm；，y₁为单核花粉变量系数 ，y₂为二核花粉变量系数 ，y₃为成熟花粉变量系数 ；z₁为单核花粉变量修正系数，z₂为二核花粉变量修正系数 ，z₃为成熟花粉变量修正系数；p₁为归属单核花粉概率，p₂为归属二核花粉概率，p₃为归属成熟花粉概率；

（4）比较p₁、p₂、p₃，其中数值最大者则为相应时期的花粉细胞。

9.一种玉米花粉发育时期准确判断方法，其特征在于，包括如下步骤：

（1）考察或测量待预测玉米植株的叶环数、雄穗上小穗长度；检测对应时期的花粉直径；

（2）将以上数据代入权利要求8所述的预测模型，计算出归属单核花粉、二核花粉、成熟花粉时期的概率，完成玉米花粉发育时期快速确定。

10.一种玉米花粉发育时期快速判断方法，其特征在于，包括如下步骤：

（1）考察或测量待预测玉米植株的叶环数、雄穗上小穗长度；检测对应时期的花粉直径；

（2）若叶环数为14～15，小穗长度8～8.6mm，此玉米花粉属于单核花粉；

若叶环数为16～17，小穗长度8.5～9.5mm，此玉米花粉属于二核花粉；

若叶环数为18～20，小穗长度9.7～11mm，此玉米花粉属于成熟花粉。