[发明专利]单核、二核及成熟玉米花粉分离方法及花粉发育阶段判定模型的构建与应用

说明书

本发明公开了一种单核、二核及成熟玉米花粉分离方法及花粉发育阶段判定模型的构建与应用。在花粉分离纯化方法中合理设置相容的样品研磨‑分离‑纯化缓冲体系，以有效的保持花粉细胞的活性，并有利于后续步骤实施；本发明研究发现了玉米植株叶环数、雄穗中部小穗长度、花粉直径与花粉发育阶段之间存在关联性，并分别建立了玉米花粉发育阶段定量数值化的判定模型和简便快捷的直观判断法，其中，模型判定法能准确判断玉米花粉所处发育时期，而直观判断法不破坏玉米雄穗、损伤包叶（叶环数、小穗长度等指标易于考察获取），操作简单、直观，解决了传统的判定方法必须破坏玉米雄穗（如要取出由叶片包裹的雄穗还必须破坏叶片）的技术难题。

本发明涉及植物生物化学技术领域，具体涉及一种单核、二核及成熟玉米花粉分离方法及花粉发育阶段判定模型的构建与应用。

背景技术

玉米花粉发育过程可以分为两个阶段：小孢子发生和雄配子体发生，小孢子发生始于雄蕊原基细胞的有丝分裂，终止于小孢子母细胞减数分裂产生小孢子。初生造孢细胞经过有丝分裂生成花粉母细胞，花粉母细胞启动减数分裂，产生四个单倍体小孢子，随着胼胝质壁解体，小孢子（单核花粉）被释放出来。雄配子发生始于释放的小孢子，终止于精细胞的形成；极化后的小孢子经过一次特殊的不对称有丝分裂，产生一个大的营养细胞和一个小的生殖细胞（二核花粉）。生殖细胞则进入第二次有丝分裂，产生两个精细胞，完成雄配子体发生，此时是三核花粉。

花粉是植物有性生殖的重要参与者，一旦花粉发育异常，会严重影响禾谷类作物产量，危害国家粮食安全。而分离得到不同发育时期花粉是研究花粉发育机制及风险预警的基础；但目前分离不同发育时期玉米花粉的方法尚无文献报道。

在实际应用中，玉米散粉期的成熟花粉可以通过抖落花粉进行分离和收集；单核花粉主要是通过体外培养和繁琐操作才可以分离少量单核花粉，而二核花粉的分离更是报道有限，更重要的是难于准确的判断出玉米花粉何时发育到二核时期，同时由于雄穗上、中、下部位的小花发育进度不一致，进一步增加了二核花粉的分离难度。

当前仅是通过玉米株高、叶片数对花粉发育时期进行粗略判断，虽然方法简单，但准确度差。而现有判断玉米花粉发育时期较准确的方法是从叶片包裹的雄穗中取出花粉进行DAPI染色镜检；但是此方法繁琐不利于实际研究应用，且花粉分离提纯难度大，必须以破坏植株雄穗为前提。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种不同发育阶段（单核、二核及成熟）玉米花粉纯化分离方法，以及解决无法分离纯化出各阶段具有生物活性的花粉细胞（如单核、双核、成熟）的技术难题。

另一方面，本发明还提供了构建玉米花粉发育阶段判定模型的方法，并应用于玉米花粉发育时期的快速确定，实现精准的数值化定量判断，以解决现有技术中花粉细胞时期判断准确度差的技术问题。

再一方面，本发明还探索建立了一种简便、直观的玉米花粉发育阶段快速判断方法，无需破坏性取样检测，以解决现有方法中操作复杂且必须破坏雄穗的技术问题。

为解决上述技术问题，本发明采用如下技术方案：

设计一种玉米花粉的分离纯化方法，包括如下步骤：

（1） 在对应的玉米花粉发育时期取雄穗中部的小穗，加入研磨缓冲液，在0～4℃下研磨得研磨液；

（2）以150～300目筛网过滤步骤（1）所得研磨液，收集滤液，再进行离心分离，弃上清液得富集沉淀物；

（3）以研磨缓冲液重悬步骤（2）所得富集沉淀物，再以Percoll密度梯度分离液对其进行离心，得沉淀物；

（4）向步骤（3）所得沉淀物加入纯化缓冲液洗涤后，离心分离得花粉细胞。

优选的，在所述步骤（1）中，以每100mL计，所述研磨缓冲液的原料组成如下：含8～12ml甘露醇、7.0～8.0mg KCl、5.4～5.8mg CaCl₂、余量为水。