[发明专利]同时检测8种动物成分的引物、试剂盒及检测方法和应用

说明书

本发明公开了一步法同时检测食品或饲料中8种动物源性成分的引物组合物、试剂盒及其检测方法和应用。利用本发明的引物、试剂盒以及检测方法经过一步多重PCR反应可以同时快速鉴定出食品或饲料中是否含有猪、牛、羊、鸡、鸭、兔、狐狸、貂中的1～8种动物源成分。本发明方法具有快速、高效、特异、灵敏、经济等优点，一步反应就能实现8种动物源成分的同时鉴定。

技术领域

本发明属于基因检测领域，具体涉及一步法同时检测食品或饲料中的猪、牛、羊、鸡、鸭、兔、狐狸、貂等8种动物源性成分的引物组合物、试剂盒及其检测方法和应用。

背景技术

食品安全是当今社会高度关注的热点话题。随着人民生活水平的提高，肉及肉制品在饮食结构中所占的比重越来越大。不法商家常常采用以次充好、掺杂使假等手段来降低肉及肉制品的成本，攫取不当利润，导致当前市场中肉及肉制品中假冒伪劣现象突出。市场中常见的肉类掺杂使假手段是用规模化饲养的价廉的动物肉(如鸡肉、鸭肉)来假冒质优价高的牛羊肉，甚至用不可食用的肉类(如狐狸肉、貂肉等)来假冒牛、羊肉和猪肉、兔肉等。

肉类的掺杂使假现象严重扰乱了市场正常秩序，侵害了消费者的正当权益，甚至危害人民生命财产安全，引发严重的食品安全问题及其他问题。人们食用了假冒伪劣肉制品后，可能因产品中含有某些致病微生物或对人体有毒有害的成分，导致生病、中毒等状况发生，或使有些对个别种类的肉类过敏的人群在不知情的情况下食用了过敏原，引发过敏性疾病。这就要求建立准确高效的肉类鉴定方法，在此基础上，食品监管部门才能加大监管以确保食品安全，保障消费者免受肉类造假带来的对权益和健康的侵害。

同样，饲料中也存在肉类蛋白原料掺杂使假情况。国内外均报道过用低值肉肉类蛋白原料假冒高值肉类蛋白原料的现象，或使用动物内脏、羽毛粉、骨粉等代替鱼粉等情况，扰乱了饲料行业的正常秩序，增加了养殖患病风险等。这也要求建立准确高效的肉类鉴定方法，在此基础上，农业监管部门才能加大监管力度以确保饲料安全，从而保障养殖安全和畜产品安全。

快速、准确、便捷、高效、经济的肉类鉴别方法是食品检测和饲料检测领域面临的难题。传统的基于形态学特征(风味、颜色、形状、口味、外观)建立的肉类鉴定方法，如感官分析法、组织学鉴别法等，无法区分不同的动物源成分。基于蛋白质分析建立的肉类鉴别方法，如电泳法、ELISA法等，存在分辨率低，易出现假阳性、假阴性结果，而且在食品和饲料加工、熟制过程中，蛋白质经历高温、高压而发生变性，影响检测结果的准确性，导致基于蛋白质分析的检测方法在熟肉制品的成分检测上尤其困难。

虽然在食品、饲料加工过程中，一些用于区分肉类的生物标记会遭到破坏。但DNA在所有组织和细胞中具有极高的稳定性和广布性，因此基于DNA的肉类鉴定方法具有良好的适用性。基于DNA的肉类鉴别方法主要有聚合酶链式反应(PCR)、多重PCR、荧光定量PCR、LAMP等。

(1)PCR：能够指数级扩增特定的DNA片段，特异性和灵敏度高，可用于鉴定造假肉类原材料和肉制品。经典的PCR是用一对特异性引物来扩增一个目标片段。传统PCR方法鉴定肉类，一次只能用一对引物来鉴定一个物种。对两种以上的肉类及其制品则要分别进行多次PCR检测才能鉴别，耗时长、成本高。

(2)多重PCR：是在同一PCR反应体系里加如2对以上的引物，同时扩增多个核酸片段，用于鉴别含有2种以上的肉类制品。多重PCR的检测效率高于传统PCR。多重PCR检测需要克服的两大难题是多重PCR引物的设计以及多重PCR反应条件的优化，前者以保证引物的特异性，后者确保检测的稳定性。

(3)实时荧光定量PCR：可以对肉制品进行定性或定量分析，灵敏度高。与PCR相比，荧光PCR省略了电泳或测序鉴定步骤。但是荧光PCR需要购置昂贵的荧光定量PCR仪以及昂贵的荧光PCR试剂盒，检测操作过程中还容易出现污染和假阳性结果。况且在多数情况下肉类检测只要求定性检测，定量检测没有现实意义。相比之下，多重PCR更适用于日常生产活动中的肉类检测，荧光PCR检测方法难以在实际中普及推广。

本发明与现有发明的区别：