[发明专利]一种检测猪流行性腹泻病毒抗体的间接ELISA检测方法及其试剂盒

说明书

本发明公开了一种检测猪流行性腹泻病毒抗体的间接ELISA检测方法及其试剂盒。本发明将编码COE蛋白的基因克隆至真核表达载体pPIC9K中后，转化入毕赤酵母GS115感受态细胞进行诱导表达，成功表达得到了重组猪流行性腹泻病毒COE蛋白。该COE蛋白的纯化生产工艺较原核表达包涵体抗原简便易行，且COE蛋白的表达量高、纯度高，更接近病毒蛋白天然结构；利用该COE蛋白作为包被抗原，成功构建了一种检测猪流行性腹泻病毒抗体的间接ELISA检测方法及其试剂盒，该方法及其试剂盒的检测结果准确度高、特异性强、敏感性高、重复性好，且该试剂盒所需要的样品量少，操作简便快捷，成本低；因此，该方法及其试剂盒在检测猪流行性腹泻病毒抗体中具有广泛的应用前景。

技术领域

本发明属于动物疫病检测技术领域。更具体地，涉及一种检测猪流行性腹泻病毒抗体的间接ELISA检测方法及其试剂盒。

背景技术

猪流行性腹泻病(Porcine epidemic diarrhea，PED)是由冠状病毒猪流行性腹泻病毒(Porcine epidemic diarrhea virus，PEDV)引起的一种急性传染病，发病猪以呕吐、水样腹泻、脱水以及哺乳仔猪高致死率为主要特征。该病最初于20世纪70年代报道于英国和比利时(Oldham，1972)，随后包括中国、日本、韩国等在内的多个亚洲国家也先后报道本病的发生，频繁爆发，并导致严重的经济损失。

猪流行性腹泻病毒(PEDV)是单链正股RNA病毒，在遗传分类上属于冠状病毒科、冠状病毒属。其基因组共编码4种主要结构蛋白，即核衣壳蛋白(N)、包膜蛋白(E)、膜蛋白(M)和纤突蛋白(S)；其中，位于病毒颗粒表面的S蛋白具有比其他任何PEDV蛋白更强的抗原性。S蛋白在介导病毒粒子进入细胞和诱导机体产生中和抗体的过程中起到关键作用，并且在感染病毒的猪中持续检测到的S 蛋白的抗体比N蛋白的抗体时间更长。因S蛋白富含许多抗原表位，是PEDV 感染免疫研究和疫苗设计的主要靶蛋白，该蛋白抗体水平及其变化动态是评价免疫效果和监测免疫状态的重要依据，同时也可以作为PEDV感染血清流行病学调查的重要指标。S蛋白由1383个氨基酸组成，与其他冠状病毒一样，它可分为两个功能区即S1区(1～789aa)和S2区(790～1383aa)；其中，位于S1区的COE 蛋白(499～638aa)被证实具有很好的免疫原性，是重要的中和表位，而基于 COE蛋白的研究多聚焦于疫苗开发。

现有技术中，关于PEDV抗体的血清学检测已被广泛应用，以评估猪场的 PEDV疫苗情况或染病猪的血清学诊断。与其他现有的血清学方法相比较，如荧光微球免疫测定(FMIA)、血清中和测试(SN)、间接免疫荧光测定(IFA) 和酶联免疫吸附实验(ELISA)是一种更加便捷、快速且经济的方法，使其适用于临床诊断。迄今为止，已经有两种类型的ELISA用于检测针对PEDV的抗体，包括间接ELISA和竞争性或封闭ELISA。基于完整病毒制品或重组病毒蛋白已经开发了间接ELISA；但是，由于全病毒培养费时，昂贵且不适合大规模生产；因此，使用异源表达系统获得重组PEDV蛋白成为研究趋势。

目前，基于PEDV的M蛋白、N蛋白、S蛋白和ORF3蛋白及PEDV全病毒的ELISA诊断试剂盒都已有报道；但是，蛋白抗原尤其是S蛋白抗原的制备主要基于原核表达系统进行表达纯化，其表达产物不能有效模拟病毒蛋白天然构象，相对费时费力，且表达量低、纯度和特异性较低。因此，开发一种简便快速、检测特异性强、敏感性高、准确度高、重复性好的PEDV抗体的检测方法以及能够商品化生产的试剂盒具有重要意义。

发明内容

本发明要解决的技术问题是克服现有PEDV抗体检测方法的缺陷和不足，提供一种检测猪流行性腹泻病毒抗体的间接ELISA检测方法及其试剂盒。

本发明的目的是提供重组猪流行性腹泻病毒COE蛋白在检测重组猪流行性腹泻病毒抗体和/或制备检测重组猪流行性腹泻病毒抗体的试剂盒中的应用。

本发明另一目的是提供一种检测猪流行性腹泻病毒抗体的间接ELISA检测方法。