[发明专利]一种评估干细胞免疫调控功能的方法

权利要求书

1.一种评估干细胞制剂免疫调控功能的方法，其特征在于，包括以下步骤：

分选将接受干细胞制剂的受体的效应细胞，所述效应细胞为CD4⁺CD25^-T细胞；

采用抗体包被的扩增磁珠，对所述分选后的效应细胞进行标准化的效应细胞扩增，所述扩增磁珠为抗人CD3抗体、CD28抗体预包被的磁珠；

基于CFSE染色标记所述扩增后的效应细胞，得到CFSE标记效应细胞；

将所述CFSE标记效应细胞与待检测干细胞制剂混合培养，所述混合培养过程包括：将待检测干细胞制剂单细胞混悬液加入接种有所述CFSE标记效应细胞的孔板的3个复孔作为检测孔；将所述扩增后未经CSFE标记的效应细胞的单细胞混悬液加入接种有所述CFSE标记效应细胞的孔板的另外3个复孔作为对照孔，混匀后培养；培养条件为：37℃、5％CO₂避光以及饱和湿度条件下培养48-96h；

采用流式细胞术检测所述混合培养中的效应细胞的增殖细胞比例，以效应细胞增殖被抑制率评估待检测干细胞制剂免疫调控功能，

效应细胞增殖被抑制率＝(对照孔增殖细胞比例均值-检测孔增殖细胞比例均值)/对照孔增殖细胞比例均值×100％。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述效应细胞的分选采用T细胞分选试剂盒制备。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述CSFE染色标记效应细胞的过程包括：CSFE存储液与PBS避光混匀，效应细胞以PBS重悬后与上述避光混匀的溶液迅速混匀；孵育、离心后去上清加入T细胞完全培养基中重悬；效应细胞以等体积的PBS重悬；且效应细胞的PBS重悬液与CSFE存储液和PBS避光混匀液的混合体积为1:1；孵育条件为：室温避光下孵育5min或4-10℃避光孵育；孵育、取300g离心5min后去上清加入2mL含10％FBS的T细胞完全培养基重悬。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述CFSE标记效应细胞的接种的过程包括：将CSFE标记效应细胞以加入了扩增磁珠的T细胞完全培养基重悬，接种于孔板中，每组安排2×3个效应细胞复孔；扩增磁珠颗粒数与CSFE标记的效应细胞数的比值为4:1-1:1；重悬后的细胞数目为5×10⁵-1×10⁶个细胞/mL；每孔细胞数目为1×10⁴-1×10⁵个细胞。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述含扩增磁珠的T细胞完全培养基的制备方法包括：在玻璃瓶中充分混匀重悬磁珠，立即吸取混匀后的磁珠至灭菌EP管，加入等体积或至少500μl基本培养基，离心去上清或置于MACS STAND上，待磁珠被充分吸附到管壁后吸去液体，再以T细胞完全培养基重悬即可。

6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，采用流式细胞术检测所述混合培养中的效应细胞的增殖情况包括：收集混合培养的细胞，充分吹打分散细胞和磁珠，于强磁场中收集细胞悬液，离心去培养基，以PBS重悬后流式上机检测，选择并分析CFSE阳性细胞即效应细胞的增殖细胞比例。