[发明专利]卵子及卵裂期胚胎的玻璃化解冻液及解冻方法

说明书

本发明涉及一种卵子及卵裂期胚胎的玻璃化解冻液及解冻方法。该玻璃化解冻液包括平衡液、解冻液1、解冻液2和解冻液3；所述平衡液包括M199培养液和血清替代物；所述解冻液1、解冻液2和解冻液3均包括M199培养液、血清替代物和海藻糖；所述平衡液、解冻液1、解冻液2和解冻液3中的血清替代物的体积分数均分别为10％～30％；解冻液1中所述海藻糖的摩尔浓度为0.8～1.2mol/L；所述解冻液2中海藻糖的摩尔浓度为0.4～0.7mol/L；所述解冻液3中所述海藻糖的摩尔浓度为0.1～0.3mol/L。本发明的玻璃化解冻液提高了卵子和卵裂期胚胎的冻融存活率。

技术领域

本发明涉及动物胚胎工程，特别是涉及一种卵子及卵裂期胚胎的玻璃化解冻液及解冻方法。

背景技术

玻璃化冷冻利用保护剂溶液在受冻时固化，从液态变为无结构的玻璃化状态，这种玻璃化状态能保持其溶液状态的分子和离子分布，并通过迅速降温可以抑制细胞内冰晶形成。玻璃化冷冻技术相较于程序化冷冻操作程序较为简单，不需要昂贵仪器，可以获得更高的复苏效率，逐渐成为世界各国生殖医学领域卵母细胞及胚胎冷冻研究的主流。

卵母细胞及胚胎经液氮冷冻后，在使用之前必须解冻。解冻作为冷冻的一个相反的过程，在解冻程序中解冻液的选择对于胚胎的存活率、质量、后续发育有着密切的关系。减少胚胎在解冻过程中的冷冻融解损伤，提高胚胎冻融存活率具有十分重要的意义。

近年来，囊胚期胚胎的玻璃化冷冻技术取得了显著的进步，冻融后存活率得到了较大的提高。囊胚期胚胎相较于卵裂期胚胎具有更好的发育潜能和耐解冻损伤性，具有更高的冻融后存活率和妊娠率。但是，囊胚由于经过了囊胚培养时期的自我筛选和淘汰，其可用胚胎率远远低于卵裂期胚胎，从而存在无胚胎可移植的风险。

而卵裂期胚胎比囊胚期胚胎的可用胚胎率更高，具有更大的应用前景。因此，探索可以提高卵裂期胚胎的冻融后存活率的方法具有重要意义。然而，目前对于卵子和卵裂期胚胎的玻璃化技术的研究较少。不同的解冻保护剂及其组合在不同胚胎解冻中效果差别较大，用于囊胚期的解冻方法对卵子或早期卵裂阶段胚胎的解冻效果较差，难以适用。

因此，仍然有待探索新的适用于卵子和卵裂期胚胎的玻璃化解冻液，以提高解冻保护效果，提高卵子和卵裂期胚胎的冻融存活率。

发明内容

基于此，本发明的目的之一是提供一种解冻保护效果好的卵子或卵裂期胚胎的玻璃化解冻液。

具体技术方案如下：

一种卵子及卵裂期胚胎的玻璃化解冻液，包括平衡液、解冻液1、解冻液2和解冻液3；

所述平衡液包括M199培养液和血清替代物；所述平衡液中血清替代物的体积分数为10％～30％，

所述解冻液1、解冻液2和解冻液3中均包括M199培养液、血清替代物和海藻糖；

所述解冻液1中血清替代物的体积分数为10％～30％，海藻糖的摩尔浓度为0.8～1.2mol/L；

所述解冻液2中血清替代物的体积分数为10％～30％，海藻糖的摩尔浓度为0.4～0.7mol/L；

所述解冻液3中血清替代物的体积分数为10％～30％，海藻糖的摩尔浓度为0.1～0.3mol/L。

本发明的另一目的是提供一种卵子或卵裂期胚胎的解冻方法，该解冻方法使用上述的玻璃化解冻液对卵子或卵裂期胚胎进行解冻。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

本发明选择海藻糖与血清替代物、M199培养液(with HEPES)复配作为解冻液1～3，并对解冻液1～3中的海藻糖的添加量进行精准控制，配合平衡液，提高了卵子和卵裂期胚胎的膜的稳定性，降低渗透损伤，提高了卵子和卵裂期胚胎的冻融存活率。