[发明专利]一种用于任意核酸编辑的组合物及方法

说明书

本发明公开了一种用于任意核酸编辑的组合物及方法。一种对任意核酸实施靶向切割的组合物，包括两个主要组分：组分A：寡核苷酸探针：寡核苷酸探针由两部分组成，一部分与靶标底物互补，另一部分具有核酸二级结构；组分B：核酸内切酶分子：该核酸内切酶分子即可以识别所述的寡核苷酸探针的核酸二级结构从而与探针结合，还可以切割DNA或者RNA底物。本发明中，寡核苷酸探针上的二级发卡结构(茎‑环结构)可以直接被核酸内切酶分子识别，形成复合物分子。该复合物分子碰撞靶标的底物的概率将大于探针和酶两个独立扩散的分子同时碰撞靶标底物的概率，从而提高基因编辑效率。

技术领域

本发明属于分子生物学技术领域，涉及一种用于任意核酸编辑的组合物及方法。

背景技术

“人类基因组计划”的完成，为阐明基因组功能以及在遗传变异和生物表型之间建立因果联系提供了可能，而高效、简便和精准的基因编辑系统是将这一可能付诸实现的重要工具。许多以此为目标的基因编辑系统被开发和应用，如锌指核糖核酸酶(ZFN)系统、转录激活样效应因子核酸酶(TALEN)系统和成簇规律间隔短回文重复系统(CRISPR-Cas)系统等。

CRISPR-Cas系统作为重要的基因编辑工具具有设计简单、切割效率高等特点，已被广泛用于细胞、动物和植物的基因组DNA编辑，并在临床和农业应用上表现出巨大的潜力，堪称基因编辑技术发展史上伟大的里程碑。但是，CRISPR-Cas系统依旧有待改进的空间。

首先，几乎所有目前文献报导的CRISPR-Cas系统都依赖PAM(protospaceradjacent motif)序列进行定位，而PAM序列有固定的碱基搭配模式，从而限制了CRISPR-Cas系统在人类基因组中的锚定范围。尽管已有研究团队利用扩展Cas蛋白家族谱以及PAM序列种类的策略部分克服了这一限制，但随着对人类基因组30亿个碱基上各种基因功能探索欲望的增强，该不利因素将愈发难以忽略。其次，作为CRISPR-Cas系统中关键的Cas9或Cas12蛋白，二者的体积较大，不利于在体内进行包装和运输，这样就对将来的基因治疗药物设计提出较高的挑战。尽管已有研究团队开发出了更小的Cas蛋白，如CasX和Cas14，但它们仍然由约1000个氨基酸组成，大小在100kDa左右，该体型毫无疑问还需要进一步缩小。另外，文献报道Cas9蛋白可以切割DNA序列，Cas13蛋白可以切割RNA序列，尚没有一种Cas蛋白可以同时很好地切割DNA和RNA，这可能会限制将来病毒击杀等方面的应用。

2016年，本课题组报道了另一种基因编辑工具系统，命名为结构导向核酸酶(structure-guided nuclease，SGN)，后文称之为第一代SGN。当时，本课题组将一种古细菌来源的flap核酸内切酶1(Afu FEN1)用于基因编辑，将Afu FEN1与Fok I的切割域(Fn1)融合构建了SGN，通过Afu FEN1识别靶基因与向导DNA探针(guide DNA，简称gDNA)之间形成的3’flap结构而锚定靶基因，并通过Fn1切割靶基因。SGN具有如下特点，首先，3’flap结构的形成不受靶基因序列的限制，因此理论上SGN可以切割基因组DNA中的任何位点。其次，SGN由约500个氨基酸组成，大小70kDa左右，体积比Cas蛋白小，更适合体内递送。除此之外，在SGN处理的细胞基因组DNA中观察到大片段缺失突变形式，其与个别碱基突变(Cas蛋白产生的突变类型)相比更容易使靶基因编码的蛋白完全沉默。上述特性使得SGN有希望成为一种新的基因组编辑工具或基因治疗工具。

但美中不足的是，第一代SGN的编辑效率较低，在斑马鱼细胞中仅为1-10％，我们研究认为，第一代SGN效率较低的原因是靶标DNA需要先被gDNA结合形成3'flap结构后，才能被SGN结合，这样两步反应大大降低了SGN的编辑效率。并且，SGN中起切割DNA作用的Fn1结构域靶向特异性相对较差，Fn1是一种非特异性内切酶，在细胞中一旦随机碰撞到非靶标区域，就会引发切割反应，是导致基因组DNA中脱靶的关键原因。

发明内容