[发明专利]卵子或卵裂期胚胎的玻璃化冷冻液及冷冻方法

说明书

本发明涉及卵子或卵裂期胚胎的玻璃化冷冻液及冷冻方法。该玻璃化冷冻液包括基础液、预保护液和保护液；所述基础液包括M199培养液和血清替代物；所述预保护液包括M199培养液、血清替代物、乙二醇、二甲亚砜和丙二醇；所述保护液包括M199培养液、血清替代物、乙二醇、二甲亚砜、丙二醇和海藻糖；所述海藻糖在所述保护液中摩尔浓度为0.3～1.0mol/L。本发明的玻璃化冷冻液可以在降低DMSO添加量的基础上，提高卵子或卵裂期胚胎膜的稳定性，降低渗透损伤，提高卵子或卵裂期胚胎的存活率。

技术领域

本发明涉及动物胚胎工程，特别是涉及一种卵子或卵裂期胚胎的玻璃化冷冻液及冷冻方法。

背景技术

玻璃化冷冻技术是将细胞及其保护剂溶液以足够快的降温速度，过冷到“玻璃化转变温度”而被固化成完全的玻璃态，并以这种玻璃态在低温下保存，避免了冰晶的形成，从而减少冰晶对细胞的冷冻损伤，达到冷冻保护的作用。

近年来，囊胚期胚胎的玻璃化冷冻技术取得了显著的进步，冻融后存活率得到了较大的提高。囊胚期胚胎相较于卵裂期胚胎具有更好的发育潜能和耐解冻损伤性，具有更高的冻融后存活率和妊娠率。但是，囊胚由于经过了囊胚培养时期的自我筛选和淘汰，其可用胚胎率远远低于卵裂期胚胎，从而存在无胚胎可移植的风险。

而卵裂期胚胎比囊胚期胚胎的可用胚胎率更高，具有更大的应用前景。因此，探索可以提高卵裂期胚胎的冻融后存活率的方法具有重要意义。然而，目前对于卵子和卵裂期胚胎的玻璃化技术的研究较少。而用于囊胚期的冷冻方法对卵子或早期卵裂阶段胚胎的冷冻效果较差，难以适用。

在玻璃化冷冻技术中，选择合适的玻璃化冷冻液十分关键。在玻璃化冷冻液中最常见的冷冻保护剂是糖类(蔗糖、葡萄糖和果糖等)、二甲亚砜和醇类溶剂(乙二醇、丙二醇和丙三醇等)。但是，不同的冷冻保护剂及其组合在不同胚胎冷冻中效果差别较大。目前在卵子及卵裂期胚胎冷冻保存中广泛使用的冷冻保护剂主要包括蔗糖、体积百分比高达15％左右的DMSO等。但是高添加量的DMSO细胞毒性较大，对胚胎有伤害作用。且现有的卵子及卵裂期胚胎冷冻液普遍存在冷冻保护效果不佳、耗时长(预保护液需作用10～15min，保护液需作用3～5min)等缺陷。因此，仍然有待探索新的适用于卵子和卵裂期胚胎的玻璃化冷冻液，以提高冷冻保护效果，降低耗时，提高卵子和卵裂期胚胎的冻融存活率。

发明内容

基于此，本申请的目的之一是提供一种DMSO添加量低、冷冻保护效果好、耗时短的卵子或卵裂期胚胎的玻璃化冷冻液。

具体技术方案如下：

一种卵子或卵裂期胚胎的玻璃化冷冻液，包括基础液、预保护液和保护液；

所述基础液包括M199培养液和血清替代物；所述基础液和血清替代物的体积比为90～110：15～30；

所述预保护液包括M199培养液、血清替代物、乙二醇、二甲亚砜和丙二醇；所述预保护液、血清替代物、乙二醇、二甲亚砜和丙二醇的体积比为90～110：10～30：5～10：1～6：1～6。

所述保护液包括M199培养液、血清替代物、乙二醇、二甲亚砜、丙二醇和海藻糖；所述保护液、血清替代物、乙二醇、二甲亚砜和丙二醇的体积比为90～110：10～30：10～20：5～10：5～10；所述海藻糖在所述保护液中摩尔浓度为0.3～1.0mol/L。

本发明的另一目的是提供一种卵子或卵裂期胚胎的冷冻方法，其使用上述的玻璃化冷冻液对卵子或卵裂期胚胎进行冷冻。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

本发明的发明人经大量的实验研究发现，选择海藻糖、乙二醇、丙二醇以特定的比例与DMSO复配作为保护液，并配合其他基础液和预保护液，可以在降低DMSO添加量的基础上，提高卵子或卵裂期胚胎膜的稳定性，降低渗透损伤，提高卵子或卵裂期胚胎的存活率。